异烟肼/链霉素耐药结核分枝杆菌新耐药位点筛查

发布时间：2021-06-06 19:48

　　结核病及耐药结核病的早发现、早治疗是提高结核病治愈率、降低死亡率的关键。然而基于固体培养的传统诊断方法检测周期长,一般为1-2个月,因此可能耽误患者的最佳治疗时机。随着分子生物学的迅速发展,出现了一批结核菌及耐药结核菌的快速基因型诊断技术;但是利用现有的异烟肼、链霉素相关耐药基因的常见突变位点（kat G、inh A、rps L、rrs）对临床异烟肼、链霉素耐药结核菌的检出率仅为60%⁸0%;因此发现新的耐药位点是提高基因型诊断检出率的基础和依据,并为改进和研发新的基因型诊断工具奠定基础,同时对全面研究耐异烟肼/链霉素结核分枝杆菌的耐药分子机制,以及发现新的药物作用靶点和研制新的抗结核药物具有深远意义。为此本研究首先评估基因型诊断技术的准确性,其次对预测出的新的耐药位点进行鉴定,最后通过控制单因素（药物）变量法,成功构建体外诱导耐异烟肼/链霉素的结核分枝杆菌模型,从而排除环境等因素对结核菌碱基突变的影响,达到有效筛查新耐药位点的目的。本研究的主要内容及研究结果如下:1、为评估实验室现有基因型诊断技术的准确性及最低检出限,并为制定合理的诊断路径提供依据。本试验对已知... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写词表
第一章 绪论
    1.1 结核病概述
        1.1.1 结核病危害及流行趋势
        1.1.2 结核分枝杆菌的感染
        1.1.3 人畜共患结核病的防治
    1.2 结核病实验室诊断方法
        1.2.1 传统细菌学诊断方法
        1.2.2 分子生物学诊断方法
        1.2.3 免疫学诊断方法
    1.3 耐药结核病实验室诊断方法
        1.3.1 传统比例法药敏试验
        1.3.2 BACTEC液体培养法
        1.3.3 分子生物学快速诊断方法
    1.4 结核分枝杆菌耐药机制
        1.4.1 异烟肼耐药的分子机制
        1.4.2 链霉素耐药的分子机制
    1.5 本课题的研究意义及主要内容
第二章 基因型诊断技术检测结核菌及其耐药性的应用评估
    2.1 引言
    2.2 实验材料与设备
        2.2.1 主要仪器设备
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 培养基和溶液配制
    2.3 实验流程
    2.4 实验方法
        2.4.1 菌株的扩增
        2.4.2 实验标本的准备
        2.4.3 罗氏固体培养
        2.4.4 基因芯片检测方法
        2.4.5 XpertMTB/RIF检测方法
        2.4.6 GenoType?MTBDRplus检测方法
    2.5 实验结果
        2.5.1 罗氏固体培养检测结果
        2.5.2 基因芯片检测结果
        2.5.3 XpertMTB/RIF检测结果
        2.5.4 GenoType?MTBDRplus检测结果
    2.6 讨论
    2.7 本章小结
第三章 异烟肼/链霉素耐药结核菌相关突变位点的鉴定
    3.1 引言
    3.2 实验材料与设备
        3.2.1 主要仪器设备
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 培养基和常用溶液配制
    3.3 实验流程
    3.4 实验方法
        3.4.1 结核分枝杆菌的扩增
        3.4.2 基因组DNA的提取
        3.4.3 PCR扩增
        3.4.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
        3.4.5 扩增产物序列分析
    3.5 实验结果
        3.5.1 基因组DNA提取
        3.5.2 异烟肼耐药结核菌相关基因的序列分析
        3.5.3 链霉素耐药结核菌相关基因的序列分析
    3.6 讨论
    3.7 本章小结
第四章 建立体外诱导耐异烟肼/链霉素结核分枝杆菌模型及耐药位点筛查
    4.1 引言
    4.2 实验材料与设备
        4.2.1 主要仪器设备
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 培养基和常用溶液配制
    4.3 实验流程
    4.4 实验方法
        4.4.1 标准菌株H37Rv体外诱导耐药试验
        4.4.2 传统比例法药敏试验
        4.4.3 诱导耐药株及未诱导对照株基因组DNA提取
        4.4.4 琼脂糖凝胶电泳分析基因组DNA的纯度和完整性
        4.4.5 Nanodrop检测基因组DNA的纯度和浓度
    4.5 实验结果
        4.5.1 不同代次不同药物浓度培养基上菌株的生长情况
        4.5.2 诱导耐药株的药敏试验结果
        4.5.3 基因组DNA质量检测
        4.5.4.所有的单核苷酸多态性（SNPs）位点分布
        4.5.5 非同义SNPs位点分布
    4.6 讨论
    4.7 本章小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
答辩委员会对论文的评定意见


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3215027