酸敏感聚（原酸酯氨基醇）的设计、制备及转染性能研究

发布时间：2017-04-27 23:07

  本文关键词：酸敏感聚（原酸酯氨基醇）的设计、制备及转染性能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段越来越受到人们的广泛关注,它通过将治疗基因导入病患组织和细胞以取代或修复致病基因的缺失,从而达到治愈疾病的目的。目前,基因治疗可应用于那些威胁人类生命的重大疾病,例如癌症、血友病、心血管疾病、病毒感染等。然而,基因治疗的关键问题在于缺乏安全高效的介导基因传递的载体。与病毒载体相比,非病毒载体由于安全性高、分子结构可灵活设计且易于大规模生产等优点已成为人们研究的重点,特别是阳离子聚合物基因载体。目前研究较多的阳离子聚合物基因载体包含聚甲基丙烯酸-N,N’-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)等。实验证明这些聚阳离子载体都能够高效地结合并压缩DNA形成稳定的纳米复合物,并且显示出较好的体外转染效果。然而,它们具有的不可生物降解性、高分子量、高电荷密度的特点也导致了高细胞毒性和阻碍细胞内释放DNA；除此之外,在介导体内转染实验中,这些聚阳离子载体会与带负电荷的血液成分相互作用,导致转染效率大幅度降低。本研究的目的是设计并制备一种新型的聚阳离子基因载体--聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)。该种聚合物的特点为主链中含有均匀分布的叔氨基和羟基,而侧链通过酸敏感原酸酯键键合三级氮。为了优化设计良好水溶性和高效压缩质粒DNA的聚阳离子基因载体POEAAs,本论文通过氨基原酸酯单体(AOE)分别与乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)之间的开环聚合反应合成了两种聚(原酸酯氨基醇)-POEAA1和POEAA2。在内涵体酸性环境下,通过POEAAs侧链上原酸酯键水解引起的三级氮断裂以及主链上均匀分布的叔氨基来精确调控细胞内DNA释放,从而提高转染效率。具体来说,一方面POEAAs聚合物侧链上原酸酯键水解引起的三级氮断裂导致复合物解体,从而促进内涵体逃逸,同时释放DNA；另一方面,POEAAs聚合物主链上均匀分布的叔氨基又可以结合和保护DNA,避免复合物释放DNA过快而导致DNA被内涵体内的核酸酶降解。通过POEAAs主链上均匀分布的羟基来提高载体/DNA复合物的生物相容性和血清条件下的转染效率。论文主要开展了以下工作：第一章：介绍了基因治疗和基因传递体系的概况,常用非病毒基因传递系统以及刺激响应性聚阳离子基因载体的制备与应用,阳离子聚合物载体介导基因传递面临的障碍及解决措施。第二章：通过AOE分别与EGDE和PEGDE之间的开环聚合反应合成POEAA1和POEAA2,对二者的结构、分子量及分子量分布进行了表征,并检测了POEAAs的酸敏感性。结果表明,POEAA1和POEAA2在温和的酸性条件下均能水解,且遵循环外机制,在偏酸性条件下,降解程度逐渐随着时间的延长逐渐增强。第三章：评价了POEAAs压缩DNA的能力、POEAAs/DNA复合物的血清稳定性,测定了POEAAs/DNA复合物的粒径及Zeta电位,最后探索了POEAAs/DNA复合物在酸性条件下释放DNA的能力。结果表明,在生理条件下,POEAA1和POEAA2均能够高效地结合和压缩DNA,且POEAA2结合DNA的能力略强于POEAA1。随着N/P比的增加,POEAA1和POEAA2的粒径逐渐减小,最终稳定在150-220 nm左右；POEAA1和POEAA2的Zeta电位随着N/P比的增加呈现上升的趋势,最终分别稳定在9 mV和23 mV左右。相对于25 kDabPEI, POEAAs/DNA复合物具有更强的抗酶能力、抗阴离子聚合物能力和抑制蛋白吸附能力,因而可以证明POEAAs/DNA复合物具有优良的血清稳定性。POEAAs/DNA复合物在酸性条件下能释放DNA,释放速率随着时间的延长而增大,且POEAA1/DNA释放DNA更快且释放量更多。第四章：评价了POEAAs介导293T细胞的毒性以及POEAAs介导293T细胞转染的转染效率以及血清对转染效率的影响。结果表明,与25 kDa bPEI(对照组)相比,POEAAs的细胞毒性明显更低,甚至当POEAAs的浓度为1 mg/mL时,细胞的存活率达到了80%以上,而当25 KDa bPEI的浓度为1 mg/mL时,细胞存活率不到20%；而且POEAA1细胞毒性比POEAA2更低。在无血清条件下,与25 KDa bPEI介导的转染效率(26.3%)相比,POEAAs的转染效率(4.12%)较低,但是在含10%血清的条件下,POEAAs介导的转染效率(4.93%)与25 KDabPEI(6.57%)的几乎相当。POEAAs的转染效率不受10%血清浓度的影响,这对于聚阳离子基因载体介导体内转染是重要的。综上所述,本工作制备的阳离子共聚物(POEAAs)具有良好的生物相容性、血清稳定性及精确调控DNA释放的能力,有望成为具有良好应用前景的聚合物基因载体。
【关键词】：原酸酯 转染 基因传递
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 基因治疗概述12
• 1.2 基因传递体系12-16
• 1.2.1 非病毒基因传递系统13-16
• 1.2.1.1 聚乙烯亚胺(PEI)14
• 1.2.1.2 树状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)14-15
• 1.2.1.3 聚赖氨酸(PLL)15-16
• 1.2.1.4 壳聚糖(CS)16
• 1.3 刺激响应性聚阳离子基因载体16-18
• 1.3.1 pH敏感基因载体17
• 1.3.2 氧化还原敏感基因载体17-18
• 1.3.3 温度敏感基因载体18
• 1.4 阳离子聚合物载体介导基因传递面临的障碍及解决措施18-21
• 1.4.1 血液循环的稳定性19
• 1.4.2 靶向细胞摄取19-20
• 1.4.3 内涵体逃逸20-21
• 1.4.4 细胞核进入21
• 1.5 选题思路及研究内容21-23
• 1.5.1 选题思路21-22
• 1.5.2 研究内容22-23
• 第二章 酸敏感聚(原酸酯氨基醇)的制备与表征23-37
• 2.1 引言23
• 2.2 实验试剂及仪器23-25
• 2.2.1 实验试剂23-24
• 2.2.2 实验仪器24-25
• 2.3 实验内容25-28
• 2.3.1 实验试剂的纯化25
• 2.3.2 AOE的合成25-27
• 2.3.3 聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)的合成27-28
• 2.4 表征方法28-29
• 2.4.1 核磁共振氢谱(~1H NMR)检测28
• 2.4.2 凝胶渗透色谱(GPC)检测28
• 2.4.3 聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)的酸敏感性检测28-29
• 2.4.3.1 不同pH缓冲溶液的配制28-29
• 2.4.3.2 POEAAs的酸敏感性检测29
• 2.5 结果与讨论29-36
• 2.5.1 化合物2的~1H NMR图谱分析29-30
• 2.5.2 AOE的~1H NMR图谱分析30-31
• 2.5.3 POEAAs的~1H NMR图谱分析31-32
• 2.5.4 POEAAs的GPC分析32-33
• 2.5.5 POEAAs的酸敏感性结果分析33-36
• 2.6 本章小结36-37
• 第三章 POEAAs/DNA复合物的制备与表征37-53
• 3.1 引言37
• 3.2 实验试剂及仪器37-38
• 3.2.1 实验试剂37-38
• 3.2.2 实验仪器38
• 3.3 实验方法38-44
• 3.3.1 质粒DNA的大量制备与纯化38-40
• 3.3.1.1 E.coliDH5α的培养39
• 3.3.1.2 质粒的提取39-40
• 3.3.2 POEAAs/DNA复合物的制备40-41
• 3.3.3 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验41
• 3.3.4 EB排阻实验41
• 3.3.5 粒径和Zeta电位测定41-42
• 3.3.6 DNase Ⅰ酶解实验42
• 3.3.7 肝素置换实验42
• 3.3.8 BSA蛋白吸附实验42-44
• 3.3.9 复合物释放DNA实验44
• 3.4 结果与讨论44-52
• 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验44-45
• 3.4.2 EB排阻实验45-46
• 3.4.3 粒径和Zeta电位的测量46-47
• 3.4.4 DNase Ⅰ酶解实验47-48
• 3.4.5 肝素置换实验48-49
• 3.4.6 BSA蛋白吸附实验49-50
• 3.4.7 复合物释放DNA实验50-52
• 3.5 本章小结52-53
• 第四章 聚阳离子载体POEAAs介导体外细胞转染及细胞毒性研究53-62
• 4.1 引言53
• 4.2 实验试剂及仪器53-54
• 4.2.1 实验试剂53-54
• 4.2.2 实验仪器54
• 4.3 实验方法54-57
• 4.3.1 细胞培养54-55
• 4.3.2 细胞毒性实验55-56
• 4.3.3 POEAAs介导293T细胞转染实验56-57
• 4.4 结果与讨论57-61
• 4.4.1 POEAAs的细胞毒性57-58
• 4.4.2 POEAAs介导293T细胞转染58-61
• 4.5 本章小结61-62
• 主要结论与展望62-63
• 参考文献63-72
• 致谢72-73
• 攻读学位期间发表的学术论文目录73

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