基于焦磷酸分析的病原菌快速检测技术研究

发布时间：2021-08-04 00:25

　　近年来,人畜共患疾病数量持续增加,食物中毒事件频发,病原菌快速检测技术成为人们生命安全与疫病防治的重要保障。现有的病原菌检测方法,如分离培养法、免疫学分析和分子微生物检测等方法在食品卫生以及临床医学等领域有着广泛应用。但这些方法均存在着一些不足,如检测周期长、操作繁琐以及成本高等。本论文以沙门氏菌为研究对象,提出一种基于焦磷酸分析的病原菌快速检测策略,针对病原菌特定基因片段设计扩增引物,将提取样本中的核酸分子进行体外核酸扩增（PCR）反应,通过直接分析PCR产物中焦磷酸,或者获取单链PCR产物延伸的焦磷酸产生化学发光信号来检测样本中是否存在特定的病原菌及其含量。在证实PCR反应扩增副产物焦磷酸量与初始DNA模板含量具有相关性的基础上,我们提出的基于焦磷酸分析病原菌快速检测技术包括两个步骤:首先,提取样本中的核酸分子,进行病原菌特定片段的PCR反应,运用焦磷酸化学发光测序技术的原理,将PCR扩增过程中产生的副产物焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下转换为可见光,并依据可见光的信号强度与焦磷酸量来推知PCR初始DNA模板含量。即通过直接分析PCR产物中焦磷酸的光化学信号,实现对病原菌的... 

【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

焦测序原理图

图 2-1 基于化学发光检测焦磷酸的原理 基于化学发光检测焦磷酸的链式反应可以看出，一分号强度，通过测量荧光信号的强度就可以用来检测焦中，(DNA)n+dNTP→(DNA)(n+1)+PPi，即 PCR 引物链产生一分子的焦磷酸（PPi）。结合以上的焦磷酸检测信号的强度来检测焦磷酸的含量，从而确定 PCR 反应浓度的 DNA 定量准值，首先需要用已知含量的 DNA 模板进行标准化ter（Life Technologies, CarLsbad, USA）定量 DNA 模 DNA 拷贝数。计算公式如下：

I. 1×TE 的配制100 mM/L Tris-HCl 和 10 mM/L EDTA（pH8.8），称 12.11g Tris 和 3.72g EDTA，加入 800 mL 蒸馏水，用 HCl 调 pH 至 8.0 定容至 1L 即制备成 10×TE，稀释 10倍使用。2.3.2.5 测量 PCR 扩增副产物焦磷酸量的仪器及其使用方法实验中用于检测荧光信号的仪器为 BPLC 微弱发光测量仪（Ultra WeakChemiluminescence Analyzaer ，中国科学院生物物理研究所），其原理是将发光的生物或化学样品置于黑暗的环境，用灵敏度极高的光探测器接受来自样品的微弱光，将其转换成电信号，再用电路放大，用微机分析处理，从而获得样品系统的发光信息。其原理如图 2-2 所示。

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]基于生物素—亲和素系统引入的蛋白质芯片研究[D]. 崔浩巍.华中科技大学 2010



本文编号：3320617