有机助溶剂的毒性考察及新型体外光学药敏试验方法的研究

发布时间：2017-04-30 16:04

  本文关键词：有机助溶剂的毒性考察及新型体外光学药敏试验方法的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的目前抗菌药物多为在水中微溶或难溶的大分子有机化合物,因此在常规药物敏感实验的活性检测中常需有机溶剂助溶。但有机溶剂可导致微生物的细胞膜受损,活性降低甚至死亡,因而影响药敏实验的准确性。因此,有必要严格控制药敏实验中有机助溶剂的种类和用量。本文尝试通过常规药物敏感实验,如肉汤稀释法和纸片扩散法对多种常用有机助溶剂的毒性进行详细考察,以各种溶剂对受试微生物活性的影响作为指标,建立溶剂种类与用量间的关系模型,为抗菌药物体外抑菌实验所用助溶剂的种类选择和添加限量提供参考。此外,实践操作中各种标准药物敏感实验周期长,动辄需要几十个小时,而且操作复杂,需要有经验的专业人员反复进行验证,耗时耗力。因此建立快速、灵敏及操作简便的药效检测方法在科研和应用方面均有极其重要的意义。本研究以常见染料—普鲁士蓝(PB)为光学探针,大肠埃希氏菌(E.coli)为模型微生物构建一种新型光学体外药效检测方法,用于快速检测药物有效性及筛选抗菌新化合物,弥补现有药敏实验方法的缺陷。方法通过常规药敏实验方法(纸片扩散法、肉汤稀释法),并参照生长曲线法测定有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)、丙酮和乙醇对E.coli及金黄色葡萄球菌(S.aureus)活性的抑制作用,通过扫描电子显微镜(SEM)观察经过有机溶剂作用后微生物形貌的变化。以K3[Fe(CN)6]为媒介体,当其与微生物接触后,可定量转移微生物呼吸作用产生的电子,并生成K4[Fe(CN)6],再与Fe Cl3发生化学反应生成PB。由于抗菌药物可抑制微生物的呼吸作用,减少K4[Fe(CN)6]的生成,继而影响PB的生成量。所以根据PB生成量与微生物呼吸作用的关系,在700 nm测定PB含量的变化用以反映药物对受试菌株的作用效力。通过考察菌浓、培养时间以及营养物质的加入等条件对方法灵敏度的影响,确定最佳实验条件,并将以PB作为探针的光学方法应用于常用抗生素药物的有效性检测。结果以肉汤稀释法考察DMSO、丙酮和乙醇3种有机助溶剂对E.coli和S.aureus均达到20%抑菌率时的浓度(体积比)分别为1.00%、0.25%、2.00%与1.00%、1.00%、0.50%;以生长曲线法考察,上述3种助溶剂对E.coli和S.aureus均达到20%抑菌率时的浓度(体积比)分别为0.5%、1.0%、0.5%与1.0%、0.5%、0.5%;而采用纸片扩散法考察时,乙醇和DMSO浓度(体积比)高达32%时才会对E.coli产生明显抑菌圈,32%(体积比)的丙酮对E.coli无明显抑菌圈出现;在实验浓度下,3种有机助溶剂浓度高达32%(体积比)时,对S.aureus均无抑菌圈出现。将三种方法进行对比后得出:当乙醇、丙酮和DMSO的浓度(体积比)均低于0.5%时,上述助溶剂的抑菌率可控制在20%以内,对细菌体活性的影响较小;相对于肉汤稀释法,助溶剂在纸片扩散法中对受试菌体的影响较小。同时,SEM结果也表明控制有机助溶剂的使用量可有效降低其对E.coli形貌的影响。将E.coli呼吸作用的受到5%抑制时抗生素的浓度定为药物的5%有效性(EC5%),考察抗菌药物对E.coli的抑制作用。通过PB光学方法测得头孢吡肟、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、哌拉西林、阿莫西林、庆大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星8种常见抗生素对20种E.coli临床分离物产生EC5%时的浓度分别为2、2、4、4、10、4、8和8 mg·L-1。除了庆大霉素,PB光学方法与美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的肉汤稀释法比较,结果具有较好的相似度(P0.05),差异有统计学意义。结论与DMSO和丙酮比较,乙醇抑制微生物的生长繁殖能力更加显著;当有机助溶剂的浓度相同时,其在液态实验条件下(肉汤稀释法和生长曲线法)对微生物的生长影响较大。因此,进行药敏实验时应综合考虑有机溶剂种类和用量以确定具体的实验方法。区别于常规药敏实验,以PB为探针的光学方法更为快捷、简便,在抗生素药效检测中具有较好的灵敏度,且所得结果与标准药敏实验所得结果相关性较好。所以,基于PB的光学检测法在临床诊断和抗生素类药物有效性检测方面具有一定的应用潜力。
【关键词】：有机溶剂 药敏实验 普鲁士蓝 光学方法 抗生素 药物有效性
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 中文论著摘要5-8
• 英文论著摘要8-12
• 英文缩略语表12-13
• 前言13-16
• 第一章 多种常规实验方法考察有机溶剂对细菌活性的影响及其安全使用限量16-32
• 实验材料与方法16-19
• 结果与讨论19-31
• 结论31-32
• 第二章 新型体外光学药敏试验方法—普鲁士蓝光学法的基础研究及应用32-43
• 实验材料与方法33-36
• 结果与讨论36-42
• 结论42-43
• 本研究创新性的自我评价43-44
• 参考文献44-50
• 文献综述50-68
• 参考文献59-68
• 在学期间科研成绩68-69
• 致谢69-70
• 个人简介70-71

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