基于微液滴数字PCR的遗传性耳聋无创检测方法的建立及应用研究

发布时间：2021-09-05 10:16

　　耳聋是一种常见的遗传病,遗传异质性高、人群携带率高,诊断价值高,普筛需求高。目前已发现有100多个基因与耳聋发生相关,中国遗传性耳聋的发病率约为1-3/1000,每年大约新增6万聋儿,包括3.5万新生听力障碍儿童和2.5万迟发性和药物性耳聋。耳聋的高发病率归结于中国人群约4-5%的突变基因携带率,基因突变检测具有很高的诊断价值。因此,本研究基于微液滴数字PCR（Droplet digital PCR,ddPCR）以口腔拭子为检测样本建立了耳聋常见突变位点无创检测方法,尤其是首次实现了药物性耳聋基因突变异质率的精准定量检测。此外,以孕妇血浆游离DNA（Cell-free DNA,cfDNA）为检材进行了耳聋无创产前检测的（Noninvasive prenatal testing,NIPT）初步研究。研究结果显示基于ddPCR的检测方法简便快速、灵敏度高、精准可靠是一种有前景的无创耳聋基因突变检测方法。首先,本研究基于ddPCR以口腔拭子为检测样本建立了超高灵敏度的耳聋无创检测方法,该方法极大降低了检测模板量且不会对被检测者造成创伤。目前耳聋突变检测方法主要有微阵列基因芯片、质谱、测序技术... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

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【学位级别】：博士

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图２．１实验流程

为了验证方法的特异性，对８个位点分别设计了?４组ｄｄＰＣＲ扩增实验，分别为??野生型组、突变型组、杂合型组和阴性对照组。每组实验重复３次。实验结果显示??８个位点的特异性为１００％。从８个位点的一维液滴检测图看（图２．２），８个位点阴??性对照组均未检测到阳性信号证明ＰＣＲ扩增体系无污染。野生型组ＦＡＭ通道检测??至酬性信号，ＶＩＣ通道未检测到阳性信号。突变型组ＶＩＣ通道检测到阳性信号，ＦＡＭ??通道未检测到阳性信号。杂合型组ＦＡＭ和ＶＩＣ通道同时检测阳性信号。最终检测??结果与预期结果一致。从液滴扩增图中可以看到杂合型组有两条阳性液滴条带，是??由于在高拷贝模板浓度下野生型和突变型同时进入一个液滴并同时扩增造成的双??阳性扩增。从定量结果看，野生型组和突变型组定量拷贝数与预期投入拷贝数一致，??杂合型组两个通道检测的拷贝数接近１：１且与野生型组和突变型组的定量结果接近，??上述结果证明野生型和突变型在扩增上不存在互相干扰。??５５??

３００ｄｅｌＡＴ纯合??突变，分别对切割后的１／２、１／４和１／８大小进行ＤＮＡ提取及Ｑｕｂｉｔ３．０定量检测，??结果见图２．４。从定量结果看（表２．１０），不同干血斑样本提取的ＤＮＡ含量有差异，??所有样本随着千血斑面积减少，提取的ＤＮＡ含量逐渐降低。当千血斑减少至１／８??时与１／２大小干血斑提取的ＤＮＡ总含量之间有显著差异（Ｐ＜０．０５）。虽然１／８干血??斑提取的ＤＮＡ含量显著降低，但仍然可以稳定提取出满足本研究需求的ＤＮＡ含量。??进一步通过ｄｄＰＣＲ对２３例干血斑样本进行特异性检测，样本包含野生型样本??３例，８个检测位点的杂合型样本１１例，纯合突变型样本９例。将２３例直径６?ｍｍ??的千血斑等比切割成１／８大小后，进行Ｑｕｂｉｔ３．０和ｄｄＰＣＲ定量检测，结果见表２．１０。??从检测结果看，２３例１／８大小干血斑提取的ＤＮＡ总量为５．５８－５１．９０?ｎｇ。本方法对??２３例１／８大小干血斑样本的检出率为１００％，与己知芯片检测结果及Ｓａｎｇｅｒ测序结??果比对一致率为１００％。ｄｄＰＣＲ定量的拷贝数与Ｑｕｂｉｔ３．０定量后估算拷贝数比较一??致

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3385164