铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶催化反应失活及机制

发布时间：2021-09-07 18:32

　　铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶（PAAS）为专利保护单通道双酶同测ELLSA新方法的候选配对标记酶及潜在化学发光新标记酶,对其进行分子工程改造筛选高活性突变体过程中,首次发现在最适反应pH及温度下,以对硝基苯酚硫酸钾（PNS）为底物、不存在任何抑制剂的反应体系中,PAAS/突变体有不同程度的反应失活现象,即自催化反应失活。通过动力学测定、抗PAAS多克隆抗体和特定多肽影响及结构分析等表征,推测可能机制,由此建立并优化自催化反应失活动力学模型,且拟合抗PAAS多克隆抗体和多肽影响的动力学过程,从而探讨PAAS自催化反应失活机制,并探索与其失活相关结构因素,以期在分子改造过程中合理阻断PAAS反应失活。1.PAAS/突变体反应失活1)同一反应条件下,连续监测PAAS/突变体在相同底物浓度及不同底物浓度下反应动力学曲线,PAAS/突变体作用于其合成底物PNS时,动力学曲线出现不同程度的弯曲现象,即自催化反应失活;反应失活程度与底物浓度有关。突变体M72K反应失活现象最明显;超高分辨质谱检测催化反应前后酶分子改变,发现M72K有氨基酸硫酸化共价修饰;2)引入抗PAAS多克隆抗体及合成的多肽（检测出发... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

PAAS/定点突变体催化反应动力学曲线

期间稳定性反应失活最严重的突变体 M72K 反应期稳定性对反应失活的影响o analyze thermostability of M72K during catalytic reaction procesType (%) 0min 5min 10min 30minM72K 100.0% 96.2% 104.9% 98.4%的 M72K 纯酶样品置于室温，在设定的时间点取酶样并加果显示 (表 2)，置于室温持续 30min 后，M72K 活力下降K 反应期间稳定性并非是其失活的主要原因。 M72K 反应失活的影响

制率仍低于 15%；室温下，30 min 内 M72K 活性仅下降 5%，反应期间；M72K 的 Km值为 32±1 μmol/L，最适反应 pH 为 9.0，以 3 mM PNS 为浓度，该浓度远大于 M72K 的 Km值，但 20 min 内产物约生成 30 μM，足预设底物浓度的 1% (图 3)，此为非正常情况的酶失活现象。该现象的物抑制、酶反应期间稳定性、底物过度消耗、反应 pH 与温度皆无关，浓度依赖性，由此推测，此特殊酶失活现象可能是 M72K 酶蛋白在催化自身发生某种变化所引起，即自催化反应失活。M72K 反应失活中间体检测 质谱检测催化反应前后 M72K 酶蛋白


本文编号：3390042