甲状旁腺激素定点生物素化及其纳米抗体的筛选

发布时间：2022-10-10 21:12

　　甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）是检测肾脏疾病,包括其多种并发症（如继发性甲状旁腺功能亢进）过程的主要指标。纳米抗体体积小、亲和力高、稳定性好、易于融合表达,是PTH相关疾病诊断与治疗的重要材料。但前期研究发现,无论是基于传统疏水作用或是无连接臂的羧基端定点包被PTH筛选方法,均很难获得能够特异结合PTH的纳米抗体,造成该结果的原因可能是上述包被方法影响了PTH的天然构象或由于空间位阻影响了抗原抗体有效结合,因此需要建立一种新的抗原包被方法,既能使PTH定点固载又能使其充分伸展、保持天然构象。本论文将借助生物素连接酶（biotin ligase,BirA）的定点修饰作用以及生物素与链霉亲和素间的特异结合作用,建立以链霉亲和素为介导,将定点生物素修饰的PTH进行定向固载,然后筛选纳米抗体的方法;为了便于获得稳定足量的定点生物素化目标蛋白,本论文还建立了一种简单的BirA定向固定化方法。研究结果如下:（1）Co³⁺介导的BirA固定化:在H₂O₂的作用下,NTA-Co²⁺-... 

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 蛋白质的定点修饰
        1.1.1 定点修饰的方法
        1.1.2 蛋白质生物素化修饰
        1.1.3 生物素-链霉亲和素定点技术的应用
    1.2 固定化酶
        1.2.1 蛋白酶的固定化方式
        1.2.2 固定化酶的应用
    1.3 甲状旁腺激素
        1.3.1 甲状旁腺激素概述
        1.3.2 甲状旁腺激素代谢与慢性肾衰竭
        1.3.3 甲状旁腺激素的检测
    1.4 纳米抗体技术
        1.4.1 纳米抗体概述
        1.4.2 纳米抗体的应用
        1.4.3 噬菌体展示库技术
        1.4.4 抗PTH纳米抗体的筛选
    1.5 本论文的研究目的、内容及意义
2 生物素连接酶的定点固载
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 材料与试剂
    2.3 主要仪器和耗材
    2.4 实验方法
        2.4.1 BirA的表达和纯化
        2.4.2 Avi tag底物的表达和纯化
        2.4.3 BirA的定点固载
        2.4.4 BirA酶催化活性检测
        2.4.5 His标签位置对BirA固载的影响
        2.4.6 EDTA对固定化BirA稳定性及活性的影响
        2.4.7 咪唑浓度对固定化BirA催化过程的影响
    2.5 实验结果及讨论
        2.5.1 BirA酶和VAD-Avi-His的表达纯化与活性分析
        2.5.2 H2O2对BirA固载效率和酶活性的影响
        2.5.3 His标签位置对BirA固载的影响
        2.5.4 EDTA和咪唑对固载BirA稳定性及活性的影响
    2.6 小结
3 固定化生物素连接酶的评价及应用
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 材料与试剂
        3.2.3 实验仪器及耗材
    3.3 实验方法
        3.3.1 HABA检测法
        3.3.2 不同pH对固载酶稳定性的影响
        3.3.3 不同温度对固载酶稳定性的影响
        3.3.4 固载酶的重复使用及贮存时间
        3.3.5 携带Avi标签PTH序列的设计及表达载体构建
        3.3.6 PTH-Avi-His的表达与纯化
        3.3.7 PTH-Avi-His生物素化
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 不同pH和温度处理对固载酶活性的影响
        3.4.2 固定化酶的重复使用及贮存时间对酶活性影响
        3.4.3 PTH-Avi-His的可溶表达及纯化
        3.4.4 利用固定化BirA生物素化PTH-Avi-His
    3.5 小结
4 生物素-链霉亲和素体系筛选纳米抗体
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 材料与试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 PTH的表达纯化
        4.3.2 测定噬菌体库的滴度
        4.3.3 纳米抗体筛选步骤
        4.3.4 噬菌体ELISA定性检测筛选结果
        4.3.5 纳米抗体序列的获得
        4.3.6 抗PTH纳米抗体表达载体的构建
        4.3.7 抗PTH纳米抗体的表达及分离纯化
        4.3.8 利用Biacore测定纳米抗体亲和常数
        4.3.9 抗PTH纳米抗体的ELISA活性检测
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 PTH的表达与纯化
        4.4.2 噬菌体库的滴度测定结果
        4.4.3 噬菌体库筛选抗PTH纳米抗体
        4.4.4 PCR获取纳米抗体序列
        4.4.5 序列分析结果
        4.4.6 纳米抗体表达载体构建结果
        4.4.7 目的蛋白的表达与纯化
        4.4.8 纳米抗体亲和常数检测
        4.4.9 ELISA检测纳米抗体的活性
    4.5 小结
结论
参考文献
附录A His-BirA酶的序列设计
附录B PTH-Avi-His的序列设计
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Detection of pancreatic cancer with normal carbohydrate antigen 19-9 using protein chip technology[J]. Xiao-Li Jin,Bin Xu,Yu-Lian Wu.  World Journal of Gastroenterology. 2014(40)

硕士论文
[1]携带定点固载标签的人PTH表达纯化及其纳米抗体的淘选[D]. 王玉凤.大连理工大学 2014



本文编号：3690359