白念珠菌耐药基因的筛选

发布时间：2022-10-19 19:35

　　目的:收集、分离和纯化江西地区白念珠菌临床菌株,监测白念珠菌对临床常用的氟康唑（Fluconazole,FLU）、伊曲康唑（Itraconazole,ITR）、酮康唑（Ketoconazole,KETO）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine,5-FC）和两性霉素B（Amphotericin B,Am B）等5种抗真菌药物的敏感性,获得主要流行型别中的耐药菌株,也为临床白念珠菌感染诊治提供一定的依据。通过RNA-seq技术获得耐药菌株5508（对FLU、ITR、KETO和5-FC耐药）在5-FC、ITR和5-FC联用ITR药物处理下分别对比无药处理的差异表达基因,进一步采用融合PCR介导的LEU-HIS-ARG基因敲除策略、Spot assay和生长曲线实验等探讨差异表达基因（QDR1基因）与白念珠菌耐药性的关系,为下一步探索白念珠菌耐药机制奠定基础。方法:1.收集、分离和纯化临床菌株,利用CHROMagar显色培养基和多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,M-PCR）鉴定法对念珠菌临床标本进行鉴定,获得白念珠菌临床菌株;2.依照美国临... 

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
中英文缩略词表
第1章 引言
    1.1 白念珠菌
    1.2 白念珠菌转录组测序
    1.3 白念珠菌基因敲除
    1.4 本论文的主要内容
    1.5 本论文的研究意义
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器和设备
        2.1.4 培养基和缓冲液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的培养及保存
        2.2.2 临床念珠菌标本的鉴定
            2.2.2.1 多重PCR鉴定
            2.2.2.2 科玛嘉显色培养基鉴定
        2.2.3 体外抗真菌药物敏感性实验
            2.2.3.1 药敏板的配制
            2.2.3.2 菌悬液的制备与接种
            2.2.3.3 孵育及结果判读
        2.2.4 白念珠菌RAPD基因分型实验
        2.2.5 白念珠菌总RNA的提取
        2.2.6 高通量测序及转录组分析
            2.2.6.1 菌株处理和总RNA的提取
            2.2.6.2 cDNA文库构建和测序
            2.2.6.3 测序数据处理与分析
        2.2.7 荧光定量PCR
        2.2.8 酸化玻璃微珠法提取白念珠菌基因组DNA
        2.2.9 PCR介导的同源重组基因敲除组件构建
            2.2.9.1 PCR同源臂和筛选标记
            2.2.9.2 PCR片段切胶回收
            2.2.9.3 融合PCR扩增同源重组基因敲除组件
            2.2.9.4 乙醇沉淀纯化DNA片段
        2.2.10 乙酸锂法转化白念珠菌
        2.2.11 同源重组基因敲除突变株阳性克隆的验证
            2.2.11.1 营养型鉴定阳性克隆
            2.2.11.2 PCR鉴定阳性克隆
        2.2.12 白念珠菌细胞计数
        2.2.13 质粒小量抽提
        2.2.14 白念珠菌生长曲线测定
        2.2.15 SpotAssay
        2.2.16 生物信息学方法
第3章 结果
    3.1 白念珠菌耐药菌株的获得
        3.1.1 临床念珠菌的分离、纯化和鉴定
        3.1.2 临床白念珠菌抗真菌药物敏感性
        3.1.3 临床白念珠菌RAPD基因分型
    3.2 白念珠菌转录组测序
        3.2.1 白念珠菌总RNA的提取与文库构建
        3.2.2 测序数据整理及质量评估
        3.2.3 参考基因组注释与基因组定位分析
        3.2.4 比对分析
        3.2.5 基因表达差异分析
        3.2.6 差异表达基因的GO分析
        3.2.7 差异表达基因的KEGG分析
        3.2.8 转录组测序结果的荧光定量PCR验证
    3.3 QDR1基因与白念珠菌耐药性关系初探
        3.3.1 QDR1基因缺失突变株的构建
            3.3.1.1 敲除组件的PCR扩增
            3.3.1.2 对QDR1基因缺失突变株的鉴定
        3.3.3 QDR1基因对白念珠菌抗真菌药物敏感性的影响
        3.3.4 QDR1基因对菌株生长的影响
第4章 讨论
    4.1 白念珠菌耐药菌株的获得
    4.2 白念珠菌的转录组学
    4.3 QDR1基因与白念珠菌耐药性的关系
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士期间研究成果
综述


【参考文献】：
期刊论文
[1]深部真菌感染治疗的现状与对策[J]. 廖万清,顾菊林.  中国感染与化疗杂志. 2007(02)

博士论文
[1]深部念珠菌的基因诊断、分子分型及耐药机制研究[D]. 李劲松.天津医科大学 2004



本文编号：3693981