基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究

发布时间：2023-11-16 19:40

　　慢性乙型肝炎(以下简称乙肝)是目前最突出的全球性公共卫生问题之一,严重威胁人类健康。尽管近些年乙肝疫苗的使用有效降低了乙肝的发病率,每年仍有1-3千万人感染乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV),约有1百万人死于HBV感染及其并发症。为了有效地控制HBV的传播,确保HBV感染者得到及时的治疗,对HBV的高效检测尤为重要。而针对HBV DNA的核酸检测技术由于其具有灵敏度高、特异性强等优势,已广泛应用于乙肝的诊断、监测、预后评价和输血筛查等方面。然而,目前临床上仍有部分HBV感染者体内存在现有方法难以检出的低浓度HBV DNA,这不仅增加了由此引发的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的发病风险,还可能造成输血以及肝移植过程中的HBV感染。此外,对乙肝病毒耐药突变的检测和监测可预防由此引发的抗病毒治疗失败。但由于“准种”的存在,部分患者体内存在难以检出的极低含量的HBV耐药突变株,在某种情况下,如肝移植、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)合并感染等,这些未检出的低含量HBV耐药突变株,可能带来严重的临床后果(如HBV感染、肝衰竭等)。因此,研发一种高灵敏度...

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摘要
Abstract
前言
    一、研发针对乙肝病毒DNA的高灵敏检测技术对乙肝的防治至关重要
        1.1 乙肝的流行概况
        1.2 高灵敏HBV DNA检测的临床意义
        1.3 现有HBV DNA检测技术仍存在诸多不足
    二、研发针对乙肝病毒耐药突变的早期检测技术是实现精准治疗的关键
        2.1 乙肝病毒耐药概述
        2.2 高灵敏检测乙肝耐药突变的重要性
        2.3 现有的乙肝病毒耐药突变检测技术仍存在诸多不足
    三、CRISPR-Cas13a系统可用于核酸的高灵敏、高特异性检测
        3.1 CRISPR-Cas13a系统简介
        3.2 CRISPR-Cas13a系统在核酸检测技术中的应用
        3.3 本文研究
第一章 基于CRISPR-Cas13a系统的高灵敏度HBV DNA检测方法的建立
    1.1 实验材料
        1.1.1 质粒载体与细胞系
        1.1.2 主要试剂
        1.1.3 主要仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 Lw Cas13a蛋白的诱导表达
        1.2.2 Lw Cas13a蛋白的纯化
        1.2.3 Lw Cas13a蛋白的Western Blot鉴定
        1.2.4 Lw Cas13a蛋白的活性检测
        1.2.5 基于PCR和 CRISPR的HBV DNA检测方法的建立
        1.2.6 数据分析
    1.3 结果
        1.3.1 Lw Cas13a蛋白电泳鉴定
        1.3.2 Lw Cas13a蛋白的Western Blot检测
        1.3.3 Lw Cas13a蛋白活性检测
        1.3.4 CRSPR-LwCas13a结合PCR的PCR-CRISPR检测方法的建立
    1.4 讨论
    1.5 本章小结
第二章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本HBV DNA的高灵敏检测
    2.1 实验材料
        2.1.1 血清样本
        2.1.2 质粒及引物
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 血清样本核酸提取
        2.2.2 血清样本HBV DNA的PCR-CRISPR检测
        2.2.3 血清样本HBV DNA的qPCR检测
        2.2.4 血清样本HBV DNA的ddPCR检测
        2.2.5 数据分析
    2.3 结果
        2.3.1 临床信息已知的血清样本HBV DNA的检测
        2.3.2 临床信息未知的血清样本HBV DNA的检测及与qPCR的比较
        2.3.3 血清样本HBV DNA的ddPCR验证
        2.3.4 PCR-CRISPR与ddPCR检测HBV DNA的结果比较
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 基于CRISPR-Cas13a系统的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的建立
    3.1 实验材料
        3.1.1 质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的设计
        3.2.2 YMDD区基因序列分析及耐药突变质粒的构建
        3.2.3 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计
        3.2.4 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的特异性检测
        3.2.5 YMDD耐药突变的灵敏度检测
    3.3 结果
        3.3.1 .YMDD突变区序列的保守性分析
        3.3.2 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计效果
        3.3.3 YMDD突变检测的灵敏度
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本乙肝病毒YMDD耐药突变的检测
    4.1 实验材料
        4.1.1 血清样本
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 血清样本核酸提取
        4.2.2 直接测序法检测血清样本中的YMDD突变
        4.2.3 qPCR法检测血清样本中的YMDD突变
        4.2.4 PCR-CRISPR检测血清样本中的YMDD突变
        4.2.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价
    4.3 结果
        4.3.1 血清样本YVDD突变检测
        4.3.2 血清样本YIDD突变检测
        4.3.4 血清样本YMDD突变的测序验证
        4.3.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 结论与展望
参考文献
附录A HBV DNA靶点序列保守性分析结果
附录B 280份血清样本基本信息
附录C 用于突变检测的144份血清样本基本信息
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢



本文编号：3864458