DNA等温扩增检测副溶血性弧菌的新技术研究
本文关键词：DNA等温扩增检测副溶血性弧菌的新技术研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：近年来,新发展起来的核酸扩增技术已广泛应用于生命科学及其相关的各个领域,对生命科学的发展发挥着重要的作用。由于聚合酶链式反应需要反复的热变性,依赖于特定的热循环仪,从而使其应用范围受到了一定的限制。因此,建立简便快速、灵敏、准确的等温核酸扩增技术对核酸的体外扩增检测具有非常重要的意义,并在临床和现场快速诊断中具有良好的应用前景。本论文构建了两种简单、快速、灵敏检测DNA的等温核酸扩增新方法。在第二章中,本论文基于邻近效应原理在等温条件下构建了DNA检测的新方法。首先,设计了两种实验方案,并对方案进行了优化。以副溶血性弧菌的特征序列为检测靶标,对实验方案进行了优化设计,并对引物的长度和浓度等条件进行优化。在最优条件下对不同浓度的靶标DNA进行检测,最低可以检测到0.1fmol,且靶标含量在100 fmol-0.1 fmol的范围内,荧光信号的POI值与靶标浓度呈良好的线性关系。该检测方法操作简单,反应迅速、对仪器的依赖性低。在第三章中,本论文构建了一种基于荧光探针检测双链DNA的新方法。该方法首先借助切刻内切酶与聚合酶的联合作用,在靶标双链DNA上引发线性链置换扩增,将双链DNA转化为单链。然后利用设计的双链荧光探针作为引物在单链DNA上引发后续反应,最终实现信号的级联放大。该方法以大肠杆菌pBluescript II KS(+)(PBS)质粒作为检测对象,最低可以检测到2.3 amol的PBS质粒;且该方法具有较强的特异性,即使双链荧光探针中只含有一个碱基错配也能将其有效的区分;为了检验该方法在实际样品中的应用,在复杂体系下对靶标进行检测,结果表明该方法具有较强的抗干扰能力。基于该方法具有简单快速、特异性高、抗干扰能力强等优点,可为海产养殖中致病微生物,如副溶血性弧菌、霍乱弧菌等致病菌的检测提供一个新的平台。
【关键词】：等温核酸扩增 副溶血性弧菌 分子信标 核酸检测 荧光探针
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440
【目录】：
- 摘要3-4
- ABSTRACT4-9
- 第一章 文献综述9-37
- 1.1 等温核酸扩增技术9-19
- 1.1.1 链置换扩增10-12
- 1.1.2 滚环扩增12-14
- 1.1.3 环介导等温扩增14-16
- 1.1.4 依赖解旋酶的等温扩增16-18
- 1.1.5 交叉引物等温扩增技术18-19
- 1.2 基于邻近效应的检测方法19-24
- 1.2.1 基于邻近效应对蛋白质的检测方法20-22
- 1.2.2 基于邻近效应对核酸的检测方法22-24
- 1.3 基于荧光探针的核酸检测方法24-34
- 1.3.1 基于Taq Man探针的核酸检测方法25-27
- 1.3.2 基于分子信标的核酸检测方法27-31
- 1.3.3 基于荧光共振能量转移原理的核酸检测方法31-34
- 1.4 分子生物学技术在副溶血性弧菌检测中的应用34-35
- 1.4.1 副溶血性弧菌及其危害简介34
- 1.4.2 副溶血性弧菌检测方法34-35
- 1.5 本论文的研究意义与主要内容35-37
- 第二章 基于邻近效应对DNA检测的新方法研究37-56
- 2.1 引言37
- 2.2 实验设计37-42
- 2.2.1 实验方案一38-40
- 2.2.1.1 实验原理38-39
- 2.2.1.2 DNA链的设计39-40
- 2.2.2 实验方案二40-42
- 2.2.2.1 实验原理40-41
- 2.2.2.2 DNA链的设计41-42
- 2.3 实验部分42-45
- 2.3.1 仪器与试剂42-43
- 2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备43-44
- 2.3.4 实时荧光检测体系44-45
- 2.3.4.1 实验方案一的反应体系44-45
- 2.3.4.2 实验方案二的反应体系45
- 2.4 结果与讨论45-55
- 2.4.1 实验方案一45-49
- 2.4.1.1 引物P的序列优化45-46
- 2.4.1.2 副溶血性弧菌的检测46-49
- 2.4.2 实验方案二49-55
- 2.4.2.1 实验机理的验证49-51
- 2.4.2.2 引物P与分子信标结合长度的优化51-52
- 2.4.2.3 引物P的浓度优化52-53
- 2.4.2.4 副溶血性弧菌的检测53-55
- 2.5 小结55-56
- 第三章 基于荧光探针检测双链DNA方法的研究56-67
- 3.1 引言56-57
- 3.2 实验部分57-60
- 3.2.1 仪器与试剂57-58
- 3.2.2 溶液的配制58
- 3.2.3 质粒DNA及副溶血性弧菌基因组DNA的提取58-60
- 3.2.3.1 碱裂解法提取PBS质粒DNA58-59
- 3.2.3.2 副溶血性弧菌基因组DNA的提取59-60
- 3.2.4 双链荧光探针的杂交60
- 3.2.5 实时荧光检测体系60
- 3.3 结果与讨论60-65
- 3.3.1 实验原理60-62
- 3.3.2 DNA链的设计62
- 3.3.3 灵敏度检测62-63
- 3.3.4 特异性检测63-64
- 3.3.5 抗干扰检测64-65
- 3.4 小结65-67
- 结论67-68
- 参考文献68-77
- 附录：论文中使用的缩略词77-78
- 致谢78-79
- 攻读硕士学位期间发表的论文目录79-80
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本文关键词：DNA等温扩增检测副溶血性弧菌的新技术研究，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：392633
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