四环素调控CGRP基因表达的腺相关病毒的构建及鉴定

发布时间：2025-02-14 21:19

　　目的:构建含有四环素(Tetracycline,Tet)诱导调控降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的重组腺相关病毒质粒,并包装9型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9,rAAV9),将其体外转染原代心肌细胞,观察重组腺相关病毒介导CGRP基因在原代心肌细胞中的表达。方法:1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒的构建以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA为模版,PCR扩增并插入双酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段,再将双酶切后的片段连接构成重组腺相关病毒质粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒的包装与鉴定将pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒与pAA-V9包装质粒、辅助质粒pHelper共同转染HEK293细胞,获得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１：技术线路图??９??

?四环素调控ＣＧＲＰ基因表达的腺相关病毒的构建及鉴定???２．２方法??实验技术路线如下图所示：??

图２－３?ｒＡＡＶ病毒制备流程示意图??２．２．３．１?ＨＥＫ２９３细胞的复苏培养与传代??（１）将ＨＥＫ２９３细胞从－８０°Ｃ冰箱取出，立即置于３７°Ｃ恒温水浴箱中，迅速解??

?四环素调控ＣＧＲＰ基因表达的腺相关病毒的构建及鉴记???（２３）短暂离心，将离心管中残余的乙醇吸出，放置于室温下干燥数分钟，加??１００Ｗ灭菌双蒸水充分混匀溶解（终浓度为：ｌＵｇ／ｐＬ），存于－２０°Ｃ冰箱备用。??２．２．３?ｒＡＡＶ病毒载体的制备和检测??

图３－１双酶切重组质粒??

酶切鉴定??将?ｐＡＡＶ－ＴＲＥ－ＣＭＶ－ｔＴＳ／ｒｔＴＡ、ｐＡＡＶ－ＴＲＥ－ＣＧＲＰ－Ｍｙｃ－ｔＴＳ／ｒｔＴＡ?经双酶切后，??对酶切产物进行琼脂凝胶电泳（如图３－１?），结果显示经双酶切后获取４３８ｂｐ的目??的片段。??ｂｏ??＿?１００００??＜—６０００??＜—３０００....

图3-2TS/dTA质粒测序结果

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本文编号：4034094