PARI在热打击炎症激活中作用的研究

发布时间：2017-07-03 18:02

  本文关键词：PARI在热打击炎症激活中作用的研究

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【摘要】：目的：研究蛋白酶活化受体1(protein activated receptor 1)PAR1在热打击引起血管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVECs)炎症激活中的作用,阐明PAR1在重症中暑小鼠全身炎症反应中的作用。方法：1.构建体外HUVECs热打击模型,采用RT-PCR及ELISA方法分别检测42℃热打击HUVECs 2 h后不同时间段TNF-α、IL-6、ICAM-1的mRNA和蛋白表达水平；2.采用荧光显微镜观察单核细胞对热打击HUVECs后粘附的影响；3.采用western blot及RT-PCR方法分别检测热打击HUVECs后不同时间段PAR1蛋白及mRNA的表达水平；4.采用PAR1 siRNA及腺病毒过表达预处理HUVECs,检测37℃及42℃热打击后8h PAR1的表达;5.采用RT-PCR检测PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后TNF-α、IL-6、ICAM-1的mRNA表达水平的影响；6.采用ELISA检测PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后细胞上清液中的TNF-α、IL-6、ICAM-1表达水平的影响；7.采用荧光显微镜观察PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后对单核细胞粘附的影响；8.构建小鼠中暑模型,免疫组化检测心、肝、肺和小肠上PAR1蛋白的表达；9.采用ELISA检测正常小鼠及重症中暑、PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠6h后血清中TNF-α、IL-6、ICAM-1的表达水平；10.采用HE染色检测PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠的脏器损伤的影响；11.观察PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠的生存率的影响。结果：1.热打击使HUVECs TNF-α、IL-6、ICAM-1 mRNA表达增加(图1.1,表1.1)；2.热打击使HUVECs炎症因子TNF-α/IL-6和粘附因子ICAM-1蛋白分泌增加(表1.2);3.热打击使单核细胞对HUVECs粘附增加(图2,表2)；4.热打击使HUVECs的PAR1 mRNA和蛋白表达增加(图3,表3)；5.PAR1 siRNA能有效降低热打击后PAR1的表达/AdPAR1有效增加热打击后PAR1的表达(图4,表4)；6.抑制或敲低PAR1可降低细胞因子TNF-α／IL-6和粘附因子ICAM-1 mRNA表达,而激活或过表达则可增加上述基因(图5.1,5.2,表5.1,5.2)；7.抑制或敲低PAR1可降低细胞因子TNF-α/IL-6和粘附因子ICAM-1蛋白分泌,而激活或过表达则可增加上述蛋白分泌(表5.3,5.4)；8.抑制PAR1可减少单核细胞对HUVECs的粘附,而激活PAR1则增强这种粘附(图6.1,表6.1)；9.敲除PAR1可减少单核细胞对HUVECs的粘附,而PAR1过表达则增强这种粘附(图6.2,表6.2)；10.PAR1蛋白在重症中暑小鼠心、肝、肺和小肠表达增加(图7)；11.抑制PAR1可降低重症中暑小鼠血清TNF-α、IL-6和ICAM-1水平,而激活PAR1则增加上述蛋白水平(表7)；12.抑制PAR1可减轻重症中暑心、肝、肺、小肠损伤,而激活PAR1则加重上述脏器损伤(图8)；13.抑制PAR1可提高重症中暑小鼠72h存活率,而激活PAR1则降低72h存活率(图9,表8)；1.热打击可导致内皮细胞PAR1活化,进而导致血管内皮细胞炎症激活通路。2.PAR1参与了重症中暑小鼠全身炎症激活。
【关键词】：蛋白酶活化受体1 重症中暑 炎症 脐静脉内皮细胞 粘附
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 引言11-16
• 第一章 PAR1在热打击致血管内皮细胞炎症激活中的作用的研究16-42
• 1.1 材料16-19
• 1.1.1 实验材料与主要试剂16-18
• 1.1.2 主要溶液配置18-19
• 1.1.3 主要实验仪器及设备19
• 1.2 实验方法19-26
• 1.2.1 HUVECs的培养19-20
• 1.2.2 THP1细胞的培养20-21
• 1.2.3 Western blot21-22
• 1.2.4 提取总RNA和RT-PCR22-24
• 1.2.5 PAR1siRNA干扰24
• 1.2.6 腺病毒转染24-25
• 1.2.7 ELISA检测细胞上清炎症及粘附因子25-26
• 1.2.8 单核细胞粘附26
• 1.2.9 统计学处理26
• 1.3 实验方法设计26-28
• 1.3.1 热打击HUVECs后TNF-α、IL-6、ICAM-1的表达26-27
• 1.3.2 观察单核细胞对热打击HUVECs后的粘附27
• 1.3.3 热打击不同时间对HUVECs PAR1蛋白及mRNA表达水平27
• 1.3.5 PAR1抑制剂、激动剂、siRNA及过表达对热打击后三种炎症因子表达的影响27-28
• 1.3.6 观察PAR1抑制剂、激动剂、siRNA及腺病毒对热打击后白细胞粘附的影响28
• 1.4 实验结果28-38
• 1.4.1 热打击使HUVECs TNF-α、IL-6、ICAM-1表达增加28-30
• 1.4.2 热打击使单核细胞对HUVECs粘附增加30-31
• 1.4.3 热打击HUVECs使PAR1 mRNA及蛋白表达增加31-32
• 1.4.4 PAR1 siRNA能有效降低热打击后PAR1的表达/AdPAR1有效增加热打击后PAR1的表达32
• 1.4.5 抑制或敲除PAR1减轻热打击后细胞因子TNF-α/IL-6和粘附因子ICAM-1 mRNA的表达；激活或过表达则可增加上述基因32-35
• 1.4.6 抑制PAR1可减少单核细胞对HUVECs的粘附,而激活PAR1则增强这种粘附35-38
• 1.5 讨论38-42
• 第二章 PAR1在重症中暑小鼠全身炎症反应中的作用42-49
• 2.1 材料42-43
• 2.1.1 实验材料与主要试剂42
• 2.1.2 主要溶液配置42
• 2.1.3 主要实验仪器及设备42-43
• 2.2 实验方法43-44
• 2.2.1 预处理小鼠43
• 2.2.2 热打击小鼠43
• 2.2.3 心脏取血43
• 2.2.4 ELISA检测血清中TNF-α、IL-6、ICAM-1炎症因子的水平43
• 2.2.5 免疫组化观察心、肝、肺、肠PAR1的表达及H & E染色观察心、肝、肺、肠的损伤43-44
• 2.2.6 各处理组小鼠存活率统计44
• 2.2.7 统计学处理44
• 2.3 实验设计44-45
• 2.3.1 观察正常及重症中暑小鼠心、肝、肺、小肠PAR1的表达44
• 2.3.2 检测正常对照及重症中暑小鼠血清中TNF-α、IL-6、ICAM-1的表达水平44
• 2.3.3 检测PAR1抑制剂及激动剂对重症中暑小鼠血清中TNF-a、IL-6、ICAM-1的水平的影响44-45
• 2.3.4 观察PAR1抑制剂及激动剂对重症中暑小鼠脏器损伤的影响45
• 2.3.5 观察PAR1抑制剂及激动剂对重症中暑小鼠生存率的影响45
• 2.4 实验结果45-47
• 2.4.1 PAR1蛋白在重症中暑小鼠心、肝、肺和小肠表达增加45
• 2.4.2 抑制PAR1可降低重症中暑小鼠血清TNF-α、IL-6和ICAM-1水平,而激活PAR1则增加上述蛋白水平45-46
• 2.4.3 抑制PAR1可减轻重症中暑心、肝、肺、小肠损伤,而激活PAR1则加重上述脏器损伤46-47
• 2.4.4 抑制PAR1可提高重症中暑小鼠72h存活率,而激活PAR1则降低72h存活率47
• 2.5 讨论47-49
• 结语49-50
• 参考文献50-54
• 附录54-55
• 在校期间发表文章55-56
• 致谢56-57
• 统计学审核证明57

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本文编号：514613