人体指甲中尿酸定量方法的建立及硫代脯氨酸结构同位素标记新型质谱衍生化试剂的开发

发布时间：2017-07-05 04:08

  本文关键词：人体指甲中尿酸定量方法的建立及硫代脯氨酸结构同位素标记新型质谱衍生化试剂的开发

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【摘要】：尿酸是生物体内一种内源性抗氧化剂,主要由食物中的嘌呤分解和细胞代谢分解的核酸而来。近年来,高尿酸血症和痛风的患病率持续增加。而痛风因在早期阶段没有明显症状,所以并不能早期发现。而且人体血尿酸水平的增高会导致心血管及其他代谢性疾病。因此迫切需要开发一种简便,廉价,高灵敏的早期诊断方法。非侵袭性指甲样本相对于血液,尿液等生物样本,具有采集方便,无感染危险,易于储存等优点,目前尚未有将其应用于痛风诊断的文献报道。本研究中使用高效液相(HPLC)-紫外检测器(UV)首次建立了对人体指甲中尿酸的定量分析方法。利用日立HPLC系统,GL Sciences公司的ODS-3色谱柱(250mm×4.6 mm I.D.,4.0 μm),流动相为磷酸盐缓冲液(74mmol/L, pH2.2):甲醇=98：2,流速1.0 mL/min,在284 nm处进行紫外检测,分析时间为10分钟。在1.0-10000 ng范围内线性关系良好(r2≥0.9999)；最低检测限(S/N=3)为2.0 pg;日内、日间精密度范围为1.68%-8.02%：平均加样回收率为103.40%。对10名健康志愿者(5男5女)10个手指中尿酸含量进行了比较。结果表明男性10个手指中尿酸含量普遍高于女性,男性和女性大拇指及小拇指中尿酸含量变动较大,然而食指、中指及无名指三个手指中尿酸含量相对稳定,所以在以后的研究中采用上述三个手指的指甲为尿酸定量分析的样本。在此,我们为了进一步验证指甲在痛风诊断中的有效性,对26名健康志愿者(22-60岁)及22名痛风患者(26-65岁)的手指甲中尿酸含量进行了比较,得出健康志愿者手指甲中尿酸定量范围为44.57±9.37 ng/mg,而痛风患者尿酸定量范围为144.7±47.93 ng/mg。痛风患者组指甲中尿酸含量明显高于健康志愿者组。具有显著性差异(p0.01),因此人体指甲中尿酸定量分析检测为痛风诊断提供了一种新的非侵袭方法。手性是内源性代谢物的一个重要特征,然而现代代谢组学研究的主流LC-MS联用技术,也无法鉴别手性代谢物。但柱前衍生化方法可以解决手性代谢物分离问题,所以我们以带手性中心的硫代脯氨酸为母体与带同位素标记苯甲酰氯进行反应,合成了具有靶向氨基官能团手性代谢物同位素标记质谱手性试剂。并应用于手性代谢物1-苯乙胺(R, S-PEA)、1-(1-萘基)乙胺(R, S-NEA)的分析,R, S-PEA分离度(Rs)为1.90, R, S-NEA分离度(Rs)为2.21,达到完全分离,分离效能良好。在质谱检测中,最佳轰击能量为40 eV时,获得高强度的特征碎片离子m/z为77。本试剂可提高手性代谢物在质谱中的灵敏度,还可以利用同位素在质谱中离子化效率相同且m/z比不同的特点筛选各种疾病的生物标志物。本方法将为手性代谢组学分析及手性生物标志物的筛选提供新的分析手段。
【关键词】：人体指甲 尿酸 痛风 HPLC-UV 硫代脯氨酸 质谱手性试剂
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.1
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 前言11-13
• 第一章 人体指甲中尿酸定量分析方法的建立与评价13-16
• 1.1 实验部分13-14
• 1.1.1 主要仪器与试剂13
• 1.1.2 HPLC流动相的制备13
• 1.1.3 HPLC色谱条件13
• 1.1.4 尿酸标准品溶液的制备13-14
• 1.1.5 人体指甲的采集与前处理14
• 1.2 结果与讨论14-16
• 1.2.1 HPLC色谱条件的优化14
• 1.2.2 线性范围和检测限14-15
• 1.2.3 精密度和稳定性15-16
• 第二章 健康人与痛风患者指甲中尿酸含量的定量分析16-29
• 2.1 实验部分16-18
• 2.1.1 主要仪器与试剂16-17
• 2.1.2 人体指甲收集方案制定17
• 2.1.3 实际采集的受试者相关信息17
• 2.1.4 HPLC色谱条件17
• 2.1.5 人体指甲中UA萃取条件17-18
• 2.1.6 人体指甲中UA的质谱分析18
• 2.1.7 健康人指甲中尿酸的定量分析18
• 2.1.8 痛风患者指甲中尿酸的定量分析18
• 2.2 结果与讨论18-21
• 2.2.1 HPLC色谱条件的优化及方法学验证18-19
• 2.2.2 人体指甲中尿酸萃取方法的优化19-20
• 2.2.3 人体指甲中UA的质谱鉴定20
• 2.2.4 健康人十指中尿酸含量的比较20
• 2.2.5 健康人和痛风患者指甲中尿酸含量的检测20-21
• 2.3 人体指甲在临床应用中的研究展望21-29
• 第三章 硫代脯氨酸结构同位素标记新型质谱衍生化试剂的合成29-37
• 3.1 实验部分29-31
• 3.1.1 仪器与试剂29
• 3.1.2 同位素标记新型质谱衍生化试剂的设计29-30
• 3.1.3 d0/d5-BZC-TZD的合成30
• 3.1.4 d0/d5-BZC-TZD的纯化30-31
• 3.1.5 新型质谱衍生化试剂的结构鉴定31
• 3.2 结果与讨论31-37
• 3.2.1 新型质谱衍生化试剂的合成与纯化31-32
• 3.2.2 新型质谱衍生化试剂质谱裂解规律32-37
• 第四章 氨基官能团手性化合物分离效能评价37-40
• 4.1 实验部分37-38
• 4.1.1 仪器与试剂37
• 4.1.2 氨基官能团手性化合物衍生化反应37
• 4.1.3 LC-MS质谱条件37-38
• 4.2 结果与讨论38-40
• 4.2.1 氨基官能团手性化合物的效能评价38-40
• 第五章 结论40-42
• 参考文献42-45
• 致谢45-46
• 附录1 硕士期间的科研成果46

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本文编号：520434