肺炎克雷伯菌CS309耐药基因检测和NDM-1基因的克隆及原核表达

发布时间：2017-07-20 20:23

  本文关键词：肺炎克雷伯菌CS309耐药基因检测和NDM-1基因的克隆及原核表达

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【摘要】：目的检测产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309是否同时携带产IMP、VIM型金属β-内酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶的耐药基因,同时构建NDM-1基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中进行表达。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增IMP、VIM和KPC耐药基因;以产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309为DNA模板,PCR扩增NDM-1全长,并将其与pGEM-T克隆载体连接后转化至大肠埃希菌DH5α,继而对阳性克隆进行双酶切,将酶切片段与pET-28α(+)表达载体连接,并转化大肠埃希菌BL21,再用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,并采用SDS-PAGE和Western blot技术验证NDM-1蛋白。结果经PCR和测序证实,该菌同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因,未扩增出VIM、KPC耐药基因。经双酶切和测序证实,原核表达质粒pET-28α(+)-NDM-1构建成功。SDS-PAGE发现,重组菌株经诱导后在28 kDa附近有明显条带,与预期蛋白大小27.9 kDa一致。Western blot表明诱导产生的融合蛋白可与NDM-1抗体特异性结合。结论肺炎克雷伯菌CS309同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因;成功构建了NDM-1基因的原核表达质粒,该质粒在大肠埃希菌BL21中高效融合表达。
【作者单位】： 长沙市第一医院检验科;中南大学湘雅医院检验科;
【关键词】： 新德里金属β-内酰胺酶型 肺炎克雷伯菌 克隆 融合蛋白
【基金】：湖南省发改委(湘发改高技[2012]1493号);湖南省发改委(湘发改投资[2014]658号) 湖南省自然科学基金(14JJ7003)
【分类号】：R440
【正文快照】： 产新德里金属|3-内酰胺酶(New Delhi metallo-13-lactamase 1,NDM-1)菌株对抗菌药物有极高的耐药性,可水解碳青霉烯类等所有|3_内酰胺类抗菌药物。如今国内外已不仅局限于输人性感染[1],产NDM-1菌株所引发患者院内感染的报道不断增多[2],给临床抗感染治疗和院感控制带来极大的

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本文编号：569872