调节性γδT细胞在急性移植物抗宿主病中的作用及机理研究

发布时间：2017-07-31 06:21

  本文关键词：调节性γδT细胞在急性移植物抗宿主病中的作用及机理研究

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【摘要】：研究背景及目的目前异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,Allo-HSCT)广泛用于治疗血液系统恶性肿瘤和非血液系统恶性肿瘤等疾病。移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)是allo-HSCT后出现涉及到皮肤、肝脏、胃肠道等多个器官的全身性免疫性疾病,可以严重影响患者的生存质量和预后,也是当前制约allo-HSCT疗效的最主要因素之一。目前在临床上根据患者发病的病程和临床表现的不同将其分为急性GVHD(Acute graft versus host disease, aGVHD)和慢性GVHD(Chroic graft versus host disease, cGVHD)两种。相关文献报道,在人类白细胞抗原(Human leucocyte antigen, HLA)相合同胞患者移植后aGVHD的发生率为30%-50%；在HLA不相合亲缘和无关供者移植后aGVHD的发生率可高达60%-80%。aGVHD的发生机制主要是由于供者和受者之间主要和次要组织相容性抗原(Major histocompatibility complex, MHC)的不同激活了供者T细胞,然后引发的涉及到多组织、多器官的特异性免疫细胞及细胞因子、炎症因子等释放的一系列的复杂过程。目前关于aGVHD一线治疗药物主要是糖皮质激素,相关文献报道其缓解率仅为50%左右；对糖皮质激素耐药的aGVHD的二线治疗药物主要有他克莫司(Tacrolimus, FK506).抗CD25单克隆抗体、骁悉(Mycophenolate mofetil,MMF)、抗胸腺细胞球蛋白(Antilymphocyte globulin, ATG)、环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)等,但文献报道这些药物有效率仅为30%左右；而这些免疫抑制剂治疗aGVHD的作用机制主要是通过抑制机体与免疫反应有关的细胞(T细胞、B细胞和巨噬细胞等)的增殖、分化,有效降低机体免疫反应,进而有效减轻组织、器官的损伤,然而过强的免疫抑制可能会导致机会性感染、肿瘤复发以及第二肿瘤的发生率增加。因此,寻求新的免疫调节机制控制GVHD的发生与发展,同时保留机体抗肿瘤和抗感染的效应具有十分重要的意义。在1995年,Sakaguchi等首次在正常人和小鼠的外周血、胸腺和脾脏组织中发现了一群表型和功能特异的T细胞,即调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)的存在,并被命名为CD4+CD25+Treg。随着对Treg细胞的研究发现其表面存在多种分子标志物,包括糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(Glucocorticoid-induced TNF-receptor-family-related protein, GITR)、L-选择素(L-selectin,CD62L)及细胞毒性T细胞相关抗原-4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)等膜分子,但这些分子均不是Treg细胞特异的标志；而后Fontenot等发现,叉头样转录因子(The forkhead or winged helix transcription,Foxp3)是Treg细胞表达的一种独特的转录因子。因此,Foxp3就被公认为是CD4+CD25+Treg最特异的标志物。现许多研究已证明此类细胞主要通过抑制T细胞增殖和细胞因子分泌等方式来发挥抑制免疫反应功能。Treg细胞在维持机体自身免疫耐受、调节外周T细胞循环池平衡、诱导实体器官移植后免疫耐受的发生及allo-HSCT后防治GVHD等方面发挥至关重要的作用。但目前随着对Treg的深入研究,发现Treg可以导致自身免疫性疾病的发生和可以向Th1、Th2和Th17细胞转化(即可塑性),以上这些问题均制约了Treg在临床上应用。相关研究认为Treg致自身免疫性疾病与Treg可塑性有关,而可塑性可能和该群细胞的不均一性有关。近些年研究发现,具有免疫调节功能的Treg并不局限于CD4+T细胞,CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞以及γδT细胞也具有免疫调节功能的亚群。因此,为了在临床能更好的利用Treg细胞亚群,我们需要对其进行更深入研究。新近一些研究发现：在正常小鼠以及肺癌、胃癌、肾癌等肿瘤患者体内存在一种不同于Treg的新型调节性T细胞,即调节性γδT细胞(regulatory yδ T cells, yδTreg),该细胞属于γδT细胞,CD25和Foxp3表达阳性,能抑制自身CD4+T细胞的增殖。有研究者将yδTreg和传统Treg(属于αβT细胞亚群)进行比较,发现相同点在于二者均表达CD25和Foxp3、可以抑制自身CD4+T细胞增殖。不同点在于γδTreg属于γδT细胞亚群,没有MHC限制性,识别抗原也不需要抗原递呈且比传统Treg细胞更具有均一性。显然γδTreg与传统的Treg细胞是两种完全不同的免疫调节细胞,关于这类新的γδTreg亚群的生物学特性目前知道得极少,与传统Treg的差异还有待更进一步的研究。目前有相关研究认为γδTreg在GVHD的发生和发展中起着重要的作用,然而关于γδTreg抑GVHD的机制尚不清楚,Hu等认为其抑GVHD的机制可能与其分泌IL-10有关。本课题组前期的一些研究结果表明：健康供者接受G-CSF动员后,外周血γδTreg细胞数会明显增多,结合临床资料发现供者γδTreg数量和移植后GVHD发生率成负相关。这些研究成果均提示γδTreg有可能成为一种理想的防治GVHD的效应细胞。为了探讨γδTreg在aGVHD中的作用及发病机理,本研究比较了allo-HSCT后aGVHD患者发病时和配对未发生aGVHD的患者,以及移植后aGVHD患者不同疾病状态时(aGVHD发病、疾病好转和进展)外周血γδTreg细胞功能亚群的表达及其相关细胞因子的表达这两个方面来研究γδTreg在aGVHD的作用和发病机理。方法1.采用流式细胞术检测allo-HSCT后24例aGVHD患者发病时与24例未发生aGVHD的配对患者(同期基本资料相匹配)外周血γδ Treg细胞功能亚群(总γδT细胞、Vδ1、Vδ2、Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD25+y8、 CD25+Vδ1、CD25+Vδ2、CD27+γδ、CD27+ Vδ1、CD27+ Vδ2和CD4+CD25+Foxp3+ (Treg)的表达比例,并结合临床资料观察外周血γδTreg细胞功能亚群表达与移植后aGVHD的关系。2.采用流式细胞术检测aGVHD患者不同疾病状态时(aGVHD发病、疾病好转和进展)外周血γδ Treg细胞功能亚群(总γδT细胞、Vδ1、V52、 Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD25+γδ、CD25+Vδ1、CD25+Vδ2、 CD27+γδ、CD27+Vδ1、CD27+Vδ2)和Treg表达比例,并结合临床资料观察外周血γδ Treg细胞功能亚群表达与移植后GVHD发生的关系。3.采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测allo-HSCT后24例aGVHD患者发病时与24例未发生aGVHD的配对患者(同期基本资料相匹配)外周血yδ Treg细胞免疫调节相关分子(Foxp3、CD25、RORc、CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、 STAT1、STAT3、T-bet、TLR8)的表达水平。4.采用RT-PCR检测aGVHD患者不同疾病状态时(aGVHD发病、疾病好转和进展)外周血γδTreg细胞免疫调节相关分子(Foxp3、CD25、RORc、 CTLA4、GATA3、GITR、IL-17A、IL-23R、STAT1、STAT3、T-bet、TLR8)的表达水平。5.蛋白液相芯片技术检测allo-HSCT后24例aGVHD患者发病时与24例未发生aGVHD的配对患者(同期基本资料相匹配)血清中细胞因子干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-17A(Interleukin-17,IL-17A)、白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)水平,分析aGVHD患者外周血中y8Treg对aGVHD转归的影响。6.蛋白液相芯片技术检测aGVHD患者不同疾病状态时(aGVHD发病、疾病好转和进展)血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-4和TNF-α水平,分析aGVHD患者外周血中γδTreg对aGVHD转归的影响。7.数据统计分析采用SPSS 19.0统计软件包进行处理。allo-HSCT后aGVHD患者发病时与未发生aGVHD的配对患者(同期基本资料相匹配)外周血yδTreg细胞功能亚群表达及其相关免疫调节相关分子表达水平的比较采用配对样本t检验；移植后aGVHD患者不同疾病状态时(aGVHD发病、疾病好转和进展)外周血yδTreg细胞功能亚群表达及其相关免疫调节相关分子表达水平的比较采用非参数检验;外周血yδTreg细胞功能亚群表达比例和移植后aGVHD发生的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P0.05为差异具有统计学意义。结果1.24对患者流式细胞术测定结果示：配对未发生aGVHD患者外周血总γδT细胞、V82细胞亚群比例显著高于aGVHD发病患者(t=-2.244,t=-5.640; P=0.044, P=0.000),而Vδ1细胞亚群比例无明显统计学(t=-2.066,P=0.061)。同一间期内,配对未发生aGVHD患者外周血Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、 CD27+γδT、CD27+Vδ1 T和Treg细胞亚群比例显著高于aGVHD发病患者(t=-3.453,t=-2.862,t=-2.548,t=-3.116,t=-2.778,t=-5.088; P=0.005,P=0.014, P=0.026,P-0.009,P=0.018,?=0.000)。两组患者外周血CD25+γδT、CD25+Vδ1、 CD25+Vδ2和CD27+Vδ2细胞亚群比例无显著统计学差异(t=-0.722,t=-1.516, t=-0.202,t=-1.613;P=-0.484, P=0.155,P=0.844, P=0.120)。外周血Foxp3+γδ T、 Foxp3+Vδ1和Foxp3+Vδ2亚群表达比例下降与移植后aGVHD发生率呈负相关(P=0.014, r,=-0.477; P=0.001,r,=-0.610; P=0.040, r,=-0.405)。2.24对患者RT-PCR检测结果示：配对未发生aGVHD患者外周血Foxp3、 T-bet、TLR8基因mRNA表达水平显著高于发生aGVHD患者(t=2.169,t=2.551,t= 3.583;;P=0.042, P=0.019,P=0.002);两组患者CD25、RORc、CTLA4、GATA3、 GITR、IL-17A、IL-23R、STAT1、STAT3基因mRNA表达水平无统计学差异(t=1.244,t=1.340,t=-2.026,t=-1.406,t=-0.650,t=1.877,r=-0.443,t=1.528,t=-0.290; P=0.234,P=0.194, P=0.056,P=0.174,P=0.524,P=0.073,P=0.663,P=0.142, P=0.775)。3.aGVHD患者发病时IL-10浓度和NF-α浓度显著高于配对未发生aGVHD患者(t=-2.512,t=-2.229;P=0.002,P=0.036);两组间IFN-γ、IL-4、IL-17A均无明显统计学差异(t=0.898, r=-0.833, r=-1.417; P=0.379,P=0.414,P=0.170)。4.15例aGVHD患者中12例患者经甲泼尼龙和环孢素治疗2周有效(包括完全缓解(CR)8例,部分缓解(PR)4例)和3例患者治疗无效病情进展,通过研究我们发现：aGVHD患者发病时Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、 CD25+γδT和CD25+Vδ1明显低于缓解时(P=0.023,P=0.008,P=0.028,P=0.008,P=0.028)；而γδT、Vδ1、Vδ2、CD27+γδT、CD27+Vδ1、CD27+V82、CD25+ Vδ2和Treg细胞亚群的变化无明显统计学差异(P=0.308,P=0.117,P=0.099, P=0.182,P=0.084,P=0.530, P=0.209,P-0.066)。同时我们也对3例经甲泼尼龙和环孢素治疗2周无效病情进展的患者外周血γδT细胞功能亚群变化进行了研究,发现aGVHD进展时Foxp3+γδT、CD27+γδT和CD25+Vδ1细胞亚群表达量有明显的下降趋势,而γδT、Vδ1、Vδ2,CD25+γδT、CD27+Vδ1、CD27+Vδ2、 CD25+Vδ2和Treg细胞亚群未发现明显的变化趋势。5. aGVHD患者发病时Foxp3、T-bet、RORc、TLR8基因的表达水平明显低于病情好转时(P=0.041,P=0.030,P=0.019,P=0.035)。而CD25、CTLA4、GATA3、 GITR、IL-17A、IL-23R、STAT-1、STAT-3基因的表达水平无明显统计学差异(P=0.95,P=421,P=0.051,P=0.605,P=0.911,P=0.547,P=0.186,P=0.809) aGVHD患者治疗无效病情进展的患者,Foxp3基因mRNA的相对表达水平与aGVHD发病患者相比有进一步下降的趋势。6.我们发现aGVHD患者发病时IL-10浓度显著高于aGVHD患者好转时(P=0.002)；而两组患者的IFN-γ、IL-17A、IL-4、TNF-α的浓度无明显变化(P=0.602,P=0.152, P=0.314, P=0.254)。aGVHD患者经治疗无效病情进展时,IL-10浓度和aGVHD发病时相比有明显升高趋势；而IFN-γ、IL-4、IL-17A、和TNF-α浓度无明显的变化趋势。结论1.与同期未发生aGVHD配对患者相比,aGVHD患者发病时外周血Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1、Foxp3+Vδ2、CD27+Foxp3+Vδ1亚群比例均显著降低。外周血Foxp3+γδT、Foxp3+Vδ1和Foxp3+Vδ2亚群表达比例下降与移植后aGVHD发生率呈负相关。2. aGVHD患者发病时Foxp3+γδ T、Foxp3+Vδ1和Foxp3+Vδ2显著低于病情好转时；aGVHD治疗无效、病情进展时Foxp3+γδ T细胞亚群表达量呈下降趋势,提示γδTreg参与aGVHD的发生和发展。
【关键词】：调节性γδT细胞 急性移植物抗宿主病 异基因造血干细胞移植
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-24
• 技术路线24-26
• 第一章 移植后aGVHD患者外周血中γδTreg的含量与aGVHD相关性26-48
• 材料与方法27-38
• 结果38-44
• 讨论44-48
• 第二章 aGVHD患者发病、好转及进展时外周血γδTreg对aGVHD转归的影响48-62
• 材料与方法48-53
• 结果53-58
• 讨论58-62
• 全文总结62-63
• 参考文献63-71
• 缩写词简表71-74
• 攻读硕士学位期间成果74-76
• 致谢76-78

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本文编号：597841