迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下耐药相关基因与蛋白的研究

发布时间：2017-08-04 18:01

  本文关键词：迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下耐药相关基因与蛋白的研究

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【摘要】：抗生素的发现使很多细菌感染性疾病得以控制,但是,随着抗生素的广泛使用,尤其是滥用和误用,导致大量的耐药菌株出现,甚至出现了多重耐药菌株和超级耐药菌株。此外,无论是临床上还是养殖业,很多细菌生物被膜的形成更是加剧了耐药性的严重性。因此,阐明细菌生物被膜的耐药机制对解决耐药性具有重大意义。一直以来,迟钝爱德华氏菌是鱼类一种重要的致病菌,该菌生物被膜的形成造成鱼类慢性感染并引起巨大的经济损失,并且抗生素的长期使用导致其非常严重的耐药性,因此应对和解决迟钝爱德华氏菌的耐药性问题已刻不容缓。因此研究迟钝爱德华氏菌生物被膜状态下的耐药机制具有重要的理论意义和应用前景。本论文利用蛋白质组学与基因组学相关研究技术,分析迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda ATCC15947)生物被膜状态下适应性耐药和获得性耐药过程中蛋白质的变化进行,并且比较抗生素敏感株和土霉素传代耐药菌株的全基因组特征,探讨迟钝爱德华氏菌生物被膜下的耐药相关蛋白与基因。本研究首先采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术,对生物被膜状态下迟钝爱德华氏菌土霉素耐药菌株(获得性耐药)和抗生素敏感菌株(对照)在土霉素胁迫下(适应性耐药)蛋白质组的变化进行分析。结果表明,在生物被膜状态下,适应性耐药共有281个蛋白发生差异表达,其中有193个下调表达,88个上调表达；获得性耐药中,共有70个蛋白变化,包括20个下调表达和50个上调表达。随后的生物信息学分析发现,在适应性耐药中多个外膜蛋白(OppA、 MalE、GlnH等)的表达下调,核糖体相关蛋白的表达上调,而与糖酵解途径、戊糖磷酸途径和TCA循环等产能代谢途径相关蛋白表达下调；在获得性耐药中,多个ATP依赖型转运蛋白(NikA、OppA、MalE等)的表达发生下降,RNA聚合酶相关蛋白表达上升。KEGG分析发现,细菌趋化作用减弱,RNA聚合酶活性增加,进而使翻译途径增强。本研究中利用q-PCR和Western blotting技术对差异蛋白中的部分差异蛋白进行进一步的验证。结果发现,核糖体、代谢途径相关酶以及ABC转运等相关基因相应的mRNA水平上的变化基本与蛋白质水平上一致；Western blotting分析表明PflB和PspB蛋白在生物被膜耐药中确实发生了变化,可能是生物被膜耐药相关蛋白。此外,由于在两种耐药行为中,细菌能量代谢途径都呈现下降趋势,因此对产能关键途径TCA循环中的两种重要酶进行了活性测定。测定结果显示,生物被膜耐药过程中琥珀酸脱氢酶(SDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(a-KGDH)的活性的确都明显下降,提示细菌可能通过下调胞内的能量代谢介导生物被膜耐药。此外,为了研究基因突变对细菌耐药的影响,本论文利用全基因组测序技术对土霉素耐药菌株和敏感菌株的基因组进行了重测序。分析比较结果表明,38个已知的基因,如pgm、ppsA、gplK、tolC等发生了突变,这些基因的位点突变可能参与了细菌耐药的过程。此外,还有8个蛋白在获得性耐药中表达水平发生变化,同时基因上也发生了突变(fliC, parB, accA等),提示这些基因的突变与获得性耐药可能有一定关系。综述所述,生物被膜状态下,迟钝爱德华氏菌可能通过以下方式介导细菌产生耐药：(1)一些外膜蛋白(OppA、MalE、GlnH等)的下调表达,降低细胞膜的通透性；(2)降低TCA循环等能量代谢途径；(3)增强翻译途径；(4)下调细菌的趋化作用：(5)一些酶和外膜蛋白相关基因的突变。这些耐药机制的发现,为解决生物被膜的耐药性提供新思路和有效候选靶标位点,对生物被膜感染性疾病的治疗具有重要意义。
【关键词】：生物被膜 迟钝爱德华氏菌 蛋白质组学 基因组学 耐药性
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 前言13-28
• 1. 抗生素耐药性13-15
• 1.1 抗生素的作用机制13-14
• 1.2 抗生素的耐药性14
• 1.3 四环素类抗生素的耐药性14-15
• 2. 细菌耐药性的研究进展15-20
• 2.1 国内外细菌耐药性的现状15-16
• 2.2 细菌耐药性的危害16-17
• 2.3 细菌的耐药机制17-19
• 2.4 细菌耐药的控制策略19-20
• 3. 细菌生物被膜耐药性研究进展20-25
• 3.1 细菌生物被膜的形成、结构和功能20-21
• 3.2 生物被膜相关感染及防治措施21-23
• 3.3 细菌生物被膜的耐药机制23-24
• 3.4 生物被膜在迟钝爱德华氏菌中的研究24-25
• 4. 迟钝爱德华氏菌及其致病机理25-26
• 4.1 迟钝爱德华氏菌简介25
• 4.2 迟钝爱德华氏菌的致病机制25-26
• 4.3 迟钝爱德华氏菌感染鱼类的防治26
• 5. 本论文主要研究内容及意义26-28
• 第二章 材料与方法28-46
• 1. 材料28-32
• 1.1 生物材料28
• 1.2 实验试剂、材料及来源28-29
• 1.3 仪器设备29-30
• 1.4 常用试剂配制30-32
• 2. 实验方法32-46
• 2.1 迟钝爱德华菌MIC的测定32
• 2.2 迟钝爱德华氏菌耐药菌株的筛选口32-33
• 2.3 生物被膜状态下迟钝爱德华菌生长曲线的测定33
• 2.4 生物被膜状态下迟钝爱德华菌全蛋白的分离纯化33
• 2.5 蛋白酶解及肽段iTRAQ标记33-34
• 2.6 LC MS/MS鉴定34
• 2.7 生物信息学分析34-35
• 2.8 迟钝爱德华氏菌基因组总DNA的提取35
• 2.9 PCR扩增反应体系及条件35-36
• 2.10 质粒的提取36-37
• 2.11 PCR产物或酶切产物的回收与纯化37
• 2.12 目的基因表达载体的构建37-38
• 2.13 连接产物的转化38
• 2.14 小量诱导验证38
• 2.15 包涵体蛋白的制备与纯化38-39
• 2.16 鼠抗血清的制备39
• 2.17 酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测鼠抗血清效价39-40
• 2.18 Western blotting40
• 2.19 生物被膜状态下迟钝爱德华氏菌总RNA提取40-41
• 2.20 RNA反转录41-42
• 2.21 q-PCR反应体积及条件42-43
• 2.22 α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)活性的测定43
• 2.23 琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)活性的测定43-44
• 2.24 全基因组重测序方法44-45
• 2.25 重测序序列的生物信息学分析45-46
• 第三章 生物被膜耐药蛋白组学的研究46-82
• 第一节 生物被膜状态下适应性耐药的蛋白质组学研究46-58
• 1. 引言46
• 2. 结果46-56
• 2.1 土霉素对迟钝爱德华氏菌的MIC值46-47
• 2.2 测定迟钝爱德华氏菌生物被膜的生长曲线47
• 2.3 生物被膜全蛋白的提取47-48
• 2.4 LC MS/MS分析48-51
• 2.5 相关性分析51
• 2.6 适应性耐药差异蛋白生物信息学分析51-56
• 3. 讨论56-57
• 4. 小结57-58
• 第二节 生物被膜状态下获得性耐药的蛋白质组学研究58-71
• 1. 引言58
• 2. 结果58-69
• 2.1 迟钝爱德华氏菌耐药菌株的筛选58-59
• 2.2 耐药菌株生物被膜生长曲线以及全蛋白的提取59-60
• 2.3 LC MS/MS分析60-65
• 2.4 相关性分析65
• 2.5 获得性耐药差异蛋白生物信息学分析65-69
• 3. 讨论69-70
• 4. 小结70-71
• 第三节 迟钝爱德华菌生物被膜耐药差异蛋白的验证71-82
• 1. 引言71-72
• 2. 结果72-80
• 2.1 q-PCR验证72-73
• 2.2 PflB和PspB抗体制备73-77
• 2.3 Western blotting分析77-78
• 2.4 琥珀酸脱氢酶(SDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性的测定78-80
• 3. 讨论80-82
• 第四章 迟钝爱德华氏菌耐药菌株基因组重测序及耐药基因筛选82-93
• 1. 引言82-83
• 2. 结果83-91
• 2.1 数据概况83-85
• 2.2 参考基因组比对结果85
• 2.3 SNP检测及统计85-86
• 2.4 InDel检测及统计86
• 2.5 耐药菌株中的SNP和InDel位点分析86-87
• 2.6 突变基因在蛋白水平上的变化87-91
• 3. 讨论91-92
• 4. 小结92-93
• 总结与展望93-95
• 参考文献95-106
• 附录106-107
• 致谢107-108
• 硕士研究生期间发表的论文108

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