内源性大麻素在大鼠神经病理痛模型中镇痛作用与谷氨酸—谷氨酰胺循环关系研究

发布时间：2017-08-05 18:21

  本文关键词：内源性大麻素在大鼠神经病理痛模型中镇痛作用与谷氨酸—谷氨酰胺循环关系研究

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【摘要】：目的：观察内源性大麻素2-AG在大鼠保留性神经损伤(spared nerve injury)神经病理痛模型中镇痛效应,确定剂量效应关系,计算半数有效量,并阐述其镇痛效应的发生是否与抑制星形胶质细胞和神经元细胞之间谷氨酸-谷氨酰胺循环有关。方法：成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠48只,体重180-220g,随机分为8组(n=6),Normal组(空白组)：空白组不做任何处理；Sham组(假手术组)：分离暴露胫神经和腓总神经后,仅穿线不结扎；SNI模型组：通过分离暴露坐骨神经三个分支,结扎并切断其中的胫神经和腓总神经,保留腓肠神经完整来建立SNI模型,但不给予任何干预措施；N.S.组(生理盐水组)：建立SNI模型成功后,鞘内穿刺注射15μ1生理盐水；2-AG干预1-4组：在建立SNI模型成功后,分别鞘内注射 2-AG 50nmol、100nmol、200nmol、400nmol。于手术前1日(BL, base line),手术后1周(1week)及鞘内给药后15、30、45、60分钟测定大鼠机械爪缩阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)。在最后一次行为学实验结束后,立即迅速处死大鼠并取脊髓标本,进行形态学及Western-Blot检测。采用免疫荧光双标记法观察Normal组大鼠、SNI模型组大鼠及SNI神经病理痛模型2-AG干预后,内源性大麻素受体CB1(cannabinoid receptor 1)、CB2 (cannabinoid receptor 2)在脊髓表达情况及与神经元细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞共表达情况；Normal组大鼠、SNI模型组大鼠及SNI模型组大鼠在2-AG干预后谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的表达变化情况。Western-Blot实验检测大麻素受体CB1蛋白、CB2蛋白及GS蛋白表达量变化情况。结果：行为学研究发现,Normal组与Sham组在术前及术后大鼠MWT均无统计学意义；与Normal组相比,SNI模型组大鼠MWT明显下降(F(1,71)=3844.857,P0.001),在观察期的(1week及15、30、45、60分钟)时间点上也存在统计学意义(P0.05)；N.S.组与SNI模型组相比,大鼠MWT无统计学意义。鞘内注射不同剂量的内源性大麻素2-AG(50,100,200,400nmol;注射剂量15μ1)后,观察到随着2-AG药物浓度的增加,对SNI诱导的大鼠神经病理性触诱发痛的抑制效应逐渐增强,且成剂量依赖关系。与SNI模型组相比,2-AG400 nmol、200 nmol、100nmol、50nmol组大鼠MWT的上升均有统计学意义(2-AG400 nmol:F(1,71)=100.898,P0.001；2-AG 200 nmol:F(1,71)=15.207,P=0.011； 2-AG 100 nmol:F(1,71)=20.214,P=0.006；2-AG 50 nmol:F(1,71)=36.554, P=0.002).通过线性回归统计分析,得出2-AG在SNI神经病理性疼痛模型中,镇痛作用的半数有效量(ED50)值为227.25nmol.形态学研究显示,与Normal组相比,神经元细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞在SNI模型组均不同程度的被激活；在Normal组观察到,CB1受体在神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞均有表达,SNI组的CB1受体表达明显增强,且主要与星形胶质细胞共表达；2-AG干预后,神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞的表达减弱,同时CB1受体的表达亦减弱。在Normal组和SNI组均未观察到CB2受体的表达。在Normal组观察GS的表达,发现呈低表达；在SNI组,GS的表达明显增强,主要在星形胶质细胞上表达；2-AG干预后,明显的抑制了GS的表达和GS与星形胶质细胞的共表达。Western-blot检测显示,CB1受体在SNI组的表达明显高于Normal组,具有统计学差异(P0.001),2-AG的干预未能影响CB1受体的表达；CB2受体在Normal组未检测出表达,但在SNI组表达量明显提高(P0.001),且2-AG的干预后,CB2受体蛋白的表达有所下降(P0.01)；同Normal组比较,GS蛋白在SNI组表达明显提高(P0.001)；2-AG干预后,GS蛋白的表达明显下降(P0.001)。结论：内源性大麻素2-AG抑制了SNI诱导的神经病理性触诱发痛,该镇痛效应的机制之一可能是通过内源性大麻素2-AG作用于星形胶质细胞上大麻素CB1受体,抑制了星形胶质细胞与神经元之间的谷氨酸-谷氨酰胺循环,从而减少了神经元突触末梢兴奋性神经递质谷氨酸的释放来实现的,但是不能排除可能通过CB2受体发挥镇痛效应,同时2-AG通过作用于神经元和小胶质细胞上的CB1受体产生镇痛效应亦不能排除。
【关键词】：内源性大麻素 2-AG 神经病理痛 星形胶质细胞 谷氨酸-谷氨酰胺循环
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R402;R-332
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-17
• 1.1 神经病理痛的产生、传导、主要临床表现及形成机制9-10
• 1.2 内源性大麻素系统与神经病理性疼痛10-13
• 1.3 星形胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用13-15
• 1.4 谷氨酸-谷氨酰胺循环在神经病理性疼痛中的作用15-17
• 第二章 材料与方法17-24
• 2.1 实验动物17-18
• 2.2 主要仪器设备18
• 2.3 主要药品及试剂18-20
• 2.4 模型建立20
• 2.5 机械痛觉测定20-21
• 2.6 鞘内注射给药21
• 2.7 免疫荧光检测21-22
• 2.8 Wsetern-blot检测22
• 2.9 实验分组22-23
• 2.10 统计学分析23-24
• 第三章 结果24-31
• 3.1 行为学实验结果24-25
• 3.1.1 Normal组、Sham组及SNI模型组大鼠MWT变化情况24
• 3.1.2 不同剂量2-AG对SNI模型大鼠痛敏行为反应抑制作用24
• 3.1.3 2-AG抑制SNI模型大鼠痛敏行为反应的ED_(50)值24-25
• 3.2 免疫荧光实验结果25-29
• 3.2.1 星形胶质细胞标志物GFAP与CB1受体表达及共表达情况25-26
• 3.2.2 小胶质细胞标志物ox-42与CB1受体表达及共表达情况26-27
• 3.2.3 神经元细胞标志物NeuN与CB1受体表达及共表达情况27-28
• 3.2.4 星形胶质细胞标志物GFAP与GS表达及共表达情况28-29
• 3.3 Western-blot实验结果29-31
• 3.3.1 CB1受体表达情况29
• 3.3.2 CB2受体表达情况29-30
• 3.3.3 GS表达情况30-31
• 第四章 讨论31-35
• 第五章 创新点与局限性35-36
• 5.1 本实验创新点35
• 5.2 本实验局限性35-36
• 第六章 结论36-37
• 参考文献37-43
• 附录一43-45
• 附录二45-46
• 在学期间的研究成果46-47
• 致谢47

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本文编号：626318