造血干细胞移植后硬皮病样慢性移植物抗宿主病的临床观察及发病机制研究

发布时间：2017-08-30 22:00

  本文关键词：造血干细胞移植后硬皮病样慢性移植物抗宿主病的临床观察及发病机制研究

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【摘要】：背景与目的慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)为异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)后一组临床表现类似于自身免疫疾病或其他免疫性疾病的临床综合征,包括经典cGVHD(移植100天后发生,无急性GVHD (aGVHD)特征)和重叠型cGVHD(兼具aGVHD和cGVHD特征),主要累及的脏器包括皮肤、口腔、肺、肝、肾、消化道、眼、生殖道、肌肉和骨骼、造血和免疫系统等,在造血干细胞移植患者中发病率约为30-70%。皮肤是cGVHD最常受累的靶器官,硬皮病样慢性移植物抗宿主病(sclerodermatous chronic graft-versus-host disease, ScGVHD)是其中较为少见的一种类型,早期报道其在骨髓移植患者中发病率约3%乜],主要表现为皮肤硬化、筋膜炎或关节挛缩,皮肤及附属器官的变化表现为皮肤硬化、萎缩、毛细血管扩张、色素沉着或脱失、红斑、挛缩、溃疡、脱发、指甲变化等4。ScGVHD可以根据硬化受累范围分为两种类型：广泛型(硬化病变累及2个以上解剖部位)和局限型(硬化病变局限于1个或2个解剖部位)。ScGVHD可降低患者生存时间和生活质量,尽管其可增强移植物抗白血病效应(graft versus leukemia effect, GVL)而减少白血病复发,但因皮肤外器官受累而导致的死亡率可高达20-40%。ScGVHD在临床表现和组织病理上与系统性硬化(systemic sclerosis, SSc)相似,但其发病机制并不相同盯]。不同于SSc, ScGVHD较少累及肺、肾、心脏等其他脏器；SSc通常由皮肤深层向表浅层发展,而ScGVHD与之相反。ScGVHD近年在国外渐受重视,已有相关大样本研究报道,国内目前报道较少,仅有少量的案例报道,而且近年国内半相合供者移植比例增加是否可能导致ScGVHD发病率和临床特征变化,是国内外学者都关切的问题。GVHD的发生发展是一个极为复杂的病理生理过程,但最终都是供者T细胞克隆识别受者不同的组织相容性抗原(histocopatibility antigen, HA),继而发生辅助性T细胞(Th)的分化不平衡和相关细胞因子风暴级联反应,引起受者正常组织损伤。T细胞的活化、增殖和分化在GVHD的发展中起着重要作用,CD4+T淋巴细胞受到刺激活化后会分化为辅助性T细胞1型(T helper 1, Thl)、Th2、Th17或调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)。近年来发现Th细胞存在其他亚群,如Th9、Th22、滤泡性辅助性T细胞(T follicular helper cells, Tfh),这些发现丰富了我们对T细胞分化的认识。Th细胞能分泌多种功能各异的细胞因子,在其共同作用下调节机体的免疫应答,在炎症反应、自身免疫性疾病和移植排斥反应过程中具有不可替代的作用。其中Thl细胞主要分泌干扰素γ(interferonγ, IFN-γ)、白介素2(interleukin-2, IL-2)、肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor a, TNF-a),Th2细胞主要产生IL-4、IL-5和IL-13,Th17细胞主要分泌IL-17、转化生长因子p(transforming growth factor β, TGF-β)、IL-21、IL-23、IL-6, Treg细胞则主要产生IL-10和TGF-β。Th细胞及其分泌的细胞因子在GVHD发生发展过程中的作用重要且十分复杂,目前认为Th1、Th17细胞比例的升高可能促进GVHD发生,Treg细胞可调节免疫而抑制GVHD反应,Th2可能与纤维化疾病相关。Th细胞亚群及其细胞因子在ScGVHD发病中的研究目前罕见报道,探索其中的机制可为进一步理解allo-HSCT后远期GVHD提供依据,从而探寻更有效的治疗手段,帮助改善移植患者的预后,提高生存质量。方法一、异基因造血干细胞移植后硬皮病样慢性移植物抗宿主病的临床特征及危险因素分析1.病例资料：选择南方医科大学南方医院血液科2012年1月至2014年12月在我院行allo-HSCT后存活大于100d的患者259例纳入回顾性分析。其中男169例,女90例,移植时中位年龄为29(10-59)岁。其中,急性髓系白血病(AML)99例,急性淋巴细胞白血病(ALL)96例,急性未分化型白血病(AUL)12例,慢性粒细胞白血病(CML)21例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)15例,骨髓增生异常综合征(MDS)7例,多发性骨髓瘤(MM)1例,再生障碍性贫血(AA)7例,阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)1例。移植时标危状态122例,高危状态137例。同胞HLA全相合移植133例,亲缘HLA不全相合71例,非亲缘移植55例。预处理方案含TBI者1 56例,不含TBI者103例。同胞全相合移植采用环孢素(CsA)+甲氨蝶呤(MTX),亲缘(非同胞)全相合或HLA1个位点不合采用CsA+MTX+霉酚酸酯(MMF),HLA2个或2个以上位点不合采用CsA+MTX+MMF+ATG(7.5或10mg/kg,商品名：即复宁),非亲缘供者移植采用CsA+MTX+ATG (7mg/kg,商品名：即复宁)。124例患者接受1-6次预防性和／或MRD检测指导的DLI。2.方法：对ScGVHD的发病率、临床表现、实验室检查进行统计分析。将259例患者按ScGVHD发生情况分为ScGVHD组(n=22)和非ScGVHD组(n=237)进行分析比较。将可能导致ScGVHD发病的因素纳入分析,包括疾病种类、移植前状态、供受者年龄性别、供者血缘、HLA配型、ABO血型、干细胞来源、移植有核细胞数、预处理方案、GVHD预防方案、是否发生过aGVHD或cGVHD、有无DLI。所有患者的随访从移植至死亡或2015年10月,中位随访时间为29(3-44)月。3.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行统计分析。单因素分析采用Pearson)(2检验、Fisher确切概率法及两独立样本t检验,多因素分析采用二分类logistic回归分析,P0.05为差异有统计学意义。二、Th1、Th2、Th17、Treg细胞及其细胞因子在ScGVHD发病中的机制研究1.病例选择：选择2015年7月至2016年3月期间南方医科大学南方医院血液科门诊或住院的确诊ScGVHD患者10例(男6例,女4例),平均年龄为28.8(18～48)岁。另选取对照者(Allo-HSCT后已获造血重建且无明显GVHD者)14例(男9例,女5例),平均年龄为28.6(19～42)岁。2.样本采集：采集ScGVHD患者和对照者清晨外周静脉血7-8m1,无菌肝素钠抗凝管收集,室温放置,4小时内处理。3.外周血单个核细胞(PBMC)的分离：采用淋巴细胞分离液Ficoll密度梯度离心法进行分离。4.流式细胞术检测IFN-γ+Th1、IL-4+ Th2、IL-17A+Th17细胞：采用流式胞内染色法,将分离后的PBMC用培养基重悬,加入刺激剂和阻断剂进行培养5-6小时,收集培养后细胞进行细胞表面染色→固定破膜→胞内因子染色,洗涤后流式上机检测。5.流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞：采用流式核内染色法,收集分离后的PBMC进行细胞表面染色→固定破核膜→封闭以减少非特异结合染色→核内因子染色,洗涤后上机检测。6.ELISA检测血浆中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A、TGF-β、TNF-a的表达量：包被→加样→加酶标抗体→加底物液显色→终止反应→结果判定。7.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行统计分析并以P0.05为差异有统计学意义。所得计量数据以均数±标准差表示,各组间均数首先进行方差齐性检验,如满足方差齐性,采用两独立样本t检验；如不满足,则采用秩转换检验方法分析。采用Pearson相关性检验分析各个变量之间的相关性。结果1.本研究中位随访时间29月,259例患者中134例(51.7%)发生cGVHD,其中轻度68例(50.7%)、中度45例(33.6%)、重度21例(15.7%)。22例患者表现为ScGVHD,即ScGVHD在移植患者中(存活大于100d)发病率为8.49%,在cGVHD患者中发病率为16.4%。ScGVHD发生中位时间为移植后12.5(4-28)月。2.本研究22例ScGVHD患者中有2例(9.1%)为关节硬化型,表现为关节挛缩、活动受限,皮肤未见明显硬化现象,其余20例(90.9%)均表现为皮肤硬化型,其中7例(31.8%)表现为局限型ScGVHD,13例(59.1%)为广泛型ScGVHD,皮损表现可见皮肤硬化、色素沉着或脱失、脱屑、溃疡、水疱形成等,均无雷诺现象。22例ScGVHD患者中有合并口腔GVHD 7例、肝脏GVHD7例、肺GVHD3例、肾脏GVHD1例,无消化道受累。20例皮肤硬化型ScGVHD患者中位RS评分值为11(2-42)分。22例ScGVHD患者有15例进行了自身免疫抗体检查,其中11例抗核抗体(ANA)阳性、2例抗线粒体抗体(AMA)阳性、1例抗着丝点抗体(ACA)阳性,抗Scl-70抗体均阴性。ScGVHD的治疗以环孢素(CsA)/他克莫司(FK506)联合糖皮质激素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、沙利度胺等免疫抑制剂为基础治疗,2例患者加用抗CD20单抗美罗华、1例加用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗,9例患者因病情进展或常规治疗无效接受了1～14次MSC输注,77.3% (17/22)的患者在治疗中受益,1例患者因闭塞性细支气管炎合并严重肺部感染而死亡,至随访终点其余患者均存活。3.单因素分析结果提示,预处理方案是否含TBI (P=0.031)、GVHD预防方案是否含MMF (P=0.046)、cGVHD (P=0.008)的发生、DLI(P=0.001)均与ScGVHD的发生具有相关性。应用logistic回归模型进行多因素分析,确定cGVHD和DLI为ScGVHD发病的独立危险因素,其中,发生过cGVHD的相对危险度(RR)为3.512(P=0.018),95%CI为1.235-9.987,有无DLI的RR为5.217(P=0.004),95%CI为1.698～16.029。4.ScGVHD患者与allo-HSCT后无GVHD的对照者进行比较,CD4+T细胞中Thl细胞比例略高(4.96±4.71 vs 3.86±3.69,P=0.527),Th2细胞比例略低(1.29±1.62 vs 2.00±1.85,P=0.344),Th17细胞比例略高(1.44±2.69 vs0.66±0.50,P=0.277)但均无统计学意义；IL-4在ScGVHD患者中的表达明显高于对照组(2.90±1.49 vs 1.54±0.97,P=0.013)5.ScGVHD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分率低于无GVHD对照组(1.73±1.69 vs 3.93±2.82,P=0.039),血浆中TGF-β的表达量明显升高(731.31±445.54 vs 328.06±222.81,P=0.008),有统计学意义。6.ScGVHD患者血浆TGF-β水平与其皮肤累及RS值呈显著正相关(r=0.703,P=0.023)。结论1.ScGVHD是allo-HSCT后一种晚期的严重并发症,在移植患者中(存活大于100d)的发病率为8.49%,在cGVHD患者中的发病率为16.4%,发生中位时间为移植后12.5(4-28)月；2.ScGVHD患者血浆TGF-β水平与患者皮肤累及RS评分正相关,提出TGF-β水平可作为本病的病情严重程度的监测指标；3.单因素分析提示预处理方案是否含TBI、GVHD预防方案是否含MMF、 cGVHD的发生和DLI是ScGVHD的发病的危险因素；多因素分析提示既往cGVHD和DLI为ScGVHD发病的独立危险因素；4.ScGVHD患者外周血CD4+T淋巴细胞亚群(Th17/Treg细胞)失衡、细胞因子(IL-4、TGF-β)分泌失调可能是本病发病机制之一,了解其发病机制可助于本病的早期诊断,提示治疗的新方向；5.ScGVHD患者外周血CD4+T细胞中Treg细胞比例明显低于对照组,提示过继回输Treg细胞用于治疗ScGVHD的可行性。
【关键词】：硬皮病样移植物抗宿主病 异基因造血干细胞移植 临床特征 危险因素 发病机制 调节性T细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-30
• 1 硬皮病样慢性移植物抗宿主病20-26
• 2 Th1、Th2、Th17、Treg细胞及其细胞因子在ScGVHD机制中的研究进展26-30
• 第一章 异基因造血干细胞移植后硬皮病样慢性移植物抗宿主病的临床特征及危险因素分析30-43
• 1 资料与方法30-33
• 2 结果33-38
• 3 讨论38-42
• 4 结论42-43
• 第二章 Th1、Th2、Th17、Treg细胞及相关细胞因子在ScGVHD发病中的机制研究43-62
• 1 主要试剂与仪器43-44
• 2 方法44-50
• 3 结果50-56
• 4 讨论56-61
• 5 结论61-62
• 全文小结与展望62-64
• 参考文献64-74
• 中英文缩略词对照表74-76
• 硕士研究生期间主要工作76-77
• 致谢77-78

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