基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-08-31 15:01

  本文关键词：基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测方法的建立与初步应用

  更多相关文章： 慢病毒载体包装系统 H7N9流感病毒 假病毒 中和试验

【摘要】：背景2013年3月31日中国首次报道了人感染H7N9禽流感病例,截止5月19日,已确诊病例786例,包括307。虽然目前没有明确的证据说明H7N9能否人传人,但是家庭聚集性病例的报道提示H7N9流感病毒有大流行的可能性。A/Anhui/1/2013(H7N9)是目前WHO推荐的H7N9流感病毒疫苗候选株之一,但经典疫苗效果评价与血清学感染调查的中和试验均涉及H7N9真病毒,需在BSL-3实验室进行,存在一定的生物安全隐患,及实验实施的不便利性。而假型病毒与真病毒相比只能一次性感染细胞、宿主范围广、滴度高、不易被血清补体灭活,可以代替真病毒进行中和抗体检测。研究目的构建A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒株假病毒,并在此基础上建立基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测方法,为H7N9流感病毒的防控提供参考。研究方法与结果一、确定了H7N9流感假病毒制备的最优重配方案为了确定H7N9流感假病毒制备的最优重配方案,采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,构建了三株不同血凝素(hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(neutraminidase,NA)重配但均表达A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病血凝素HA的假病毒,结果表明H7N9流感病毒自身基因优化型HA和NA重配可获得高感染力与良好血凝活性的AHop-H7N9pp假病毒。确定后续假病毒制备条件优化研究选用此重配方式。二、 AHop-H7N9pp假病毒制备条件参数的优化及生物学活性分析为了确定AHop-H7N9pp假病毒制备的最优条件,本研究对假病毒制备相关参数进行了优化,包括膜质粒组合、膜质粒与骨架质粒配比、质粒复合物与转染试剂配比、维持液血清浓度、换液时间、收货时间等,并对优化条件后制备假病毒的生物学活性进行分析。结果如下：①假病毒制备质粒相关参数优化确定为：以H7N9自身HA与NA作为膜质粒,采用骨架质粒与膜质粒质量比为3：1,质粒复合物与转染试剂质量体积比为1：2混合,转染293FT细胞。②质粒转染后相关参数优化确定为：质粒转染293FT细胞后10h换含2%FBS的维持液,培养48h后收获上清。③确定了假病毒收获后纯化方法。为了后期使用假病毒的均一性及便于储存,批量制备假病毒的纯化方案为：收获的假病毒上清液经2500rpm离心5min,然后使用20%蔗糖垫层24000rpm超离2h,可高效获得流感假病毒AHop-H7N9pp。④纯化的假病毒对多种流感疫苗小鼠血清中和试验结果表明,该假病毒具有高度特异性,可用于H7N9中和抗体检测。三、基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测完成基于假病毒的10份H7N9病人恢复期血清及1120份H7N9人群流调血清中和抗体的检测,结果表明,本研究构建的基于H7N9假病毒的中和抗体检测方法与真病毒中和试验方法具有良好的相关性。结论本研究确定了基于慢病毒载体包装系统制备表达A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒HA与NA的H7N9假病毒的各条件参数,获得了具有高感染性、良好血凝活性及中和型特异性的AHop-H7N9pp假病毒；并建立了基于此假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测方法,为我国H7N9流感病中和抗体检测提供了新的技术参考。
【关键词】：慢病毒载体包装系统 H7N9流感病毒 假病毒 中和试验
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文缩略词表11-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-24
• 结果24-40
• 第一部分 三种重配方案对表达H7N9流感病毒安徽株HA的假病毒感染性和血凝活性的影响24-29
• 一、假病毒制备所需质粒的鉴定与提取24-25
• 二、三种重配方案均能包装出含有HA蛋白和p24抗原的假病毒25
• 三、三种重配方案均能包装出具有感染活性的假病毒25-26
• 四、H7N9安徽株自身HA和NA重配可获得良好血凝活性的假病毒26-28
• 小结28-29
• 第二部分 AH_(op)-H7N9pp流感假病毒制备条件的优化及生物学活性分析29-36
• 一、假病毒制备条件的优化29-30
• 二、假病毒生物学活性的鉴定30-35
• 小结35-36
• 第三部分 基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗体检测36-40
• 一、AH_(op)-H7N9pp假病毒中和试验与真病毒中和试验结果具有较好相关36-37
• 二、H7N9流感病毒人群流调血清中和抗体检测37-39
• 小结39-40
• 讨论40-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-48
• 综述48-59
• 参考文献54-59
• 致谢59-60
• 个人简历60-62

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本文编号：766256