‘阳光玫瑰’葡萄病毒病原鉴定与脱毒技术研究

发布时间：2020-03-29 22:45

【摘要】：'阳光玫瑰'(Vlabruscana Bailey×V.vinifera L.Shine Muscat)是近年兴起的一种鲜食二倍体欧美杂交种葡萄。该品种是日本果树所经'安云津21号'(Akitsu-21)×'白南'(Hakunan V.vinifera)杂交选育而来。该品种呈黄绿色,果皮薄而果肉硬脆,正常栽培管理下可溶性固形物能达20%,具有诸多优良性状。但'阳光玫瑰,在我国各地栽培中普遍表现类似病毒病症状,包括叶片反卷、畸形、透明斑等等,对果实产量、质量造成严重影响。为此本研究展开了针对'阳光玫瑰'病毒病原鉴定,并探究高效的检测方法;探究适合'阳光玫瑰'的组织培养体系和脱毒技术。主要研究结果如下:1.不同果园'阳光玫瑰'树体调查发现类病毒病症状主要表现在叶片上,叶片表现不同类型的畸形,包括泡状皱缩、皱缩畸形、塔状畸形、叶缘反卷等。春季萌发后当年扦插苗、两年生幼树较多年生树容易表现症状,但是树势较旺的树体上一般至开花前均不表现症状,在挂果后至落叶前病树会大量表现病症。2.应用RT-PCR检测及核苷酸序列测定技术进行病原鉴定选定的10个品种调查样品中含有葡萄灰比诺病毒(GVPV)、葡萄卷叶伴随3型病毒(GLRaV-3)、葡萄斑点病毒(GFkV)、沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄病毒E(GVE)这6种病毒。其中'阳光玫瑰'含有GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE这5种病毒,且其检出率均高于平均检出率,5种病毒复合感染率达36.36%。3.优化模板浓度、引物浓度、聚合酶浓度等参数,建立了葡萄皱木复合病相关病毒GRSPaV、GVB、GVE的多重RT-PCR检测体系,即包含TaqMix 6 ul、模板cDNA1μl、GRSPaV对应特异性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl体系;以及引起葡萄叶片畸形的相关病毒GVPV、GLRaV-3、GFkV的多重RT-PCR检测体系,即包含TaqMix 6 ul、模板cDNA1μl、GLRaV-3对应特异性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl体系。4.'阳光玫瑰'单芽茎段为外植体的组织培养快速繁殖体系建立。无菌环境下离体培养诱使定芽萌发成株,其中外植体最佳消毒处理为0.1%氯化汞处理12 min,成活率为51.7%;最适茎段初代培养基激素水平为0.5mg/L6-BA+0.5mg/L KT,萌发率为56.2%;最适继代培养基为MS+0.5mg/L6-BA,增殖率为1.89;最适生根培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA。5.'阳光玫瑰,茎尖组织培养体系建立。采用茎尖组织诱导再生的方法,其中外植体最佳消毒方案为0.1%氯化汞处理8 min,0.1 mm大小的外植体成活率为 64.4%;最适茎尖初代培养基为 1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IBA。6.'阳光玫瑰'葡萄脱毒健康种苗创制。采用多种脱毒方法,包括茎尖组织培养、热处理脱毒、热处理结合茎尖组织培养、超低温处理结合茎尖组织培养。其中热处理结合茎尖组织培养优于其他方法,表现最佳,再生率为90%,GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE 的脱毒率分别为 100.0%、80.0%、95.0%、70.0%、45.0%。
【图文】：

比较退火温度为５０°Ｃ与５５°Ｃ的多组不同体系多重ＲＴ－ＰＣＲ反应均无明显差逡逑异，但是引物浓度的变化区别明显。退火温度为５５°Ｃ的条件下，比较不同模板逡逑量、引物和Ｔａｑ酶浓度的７种组合的多重ＲＴ－ＰＣＲ反应（图２．２，图２．３），发现逡逑适当增加Ｔａｑ酶浓度并调节引物浓度可以有效优化多重ＲＴ－ＰＣＲ体系。在逡逑ＧＲＳＰａＶ、ＧＶＢ、ＧＶＥ的多重检测中，最佳组合采用包含ＴａｑＭｉｘ邋６邋ｕｌ、模板ｃＤＮＡ逡逑１邋Ｈｉ、ＧＲＳＰａＶ对应特异性上下游引物各０．６卟其他引物各０．４邋ｎｌ的１０邋ｐｉ体系；逡逑在ＧＶＰＶ、ＧＬＲａＶ－３、ＧＦｋＶ的多重检测中，最佳组合采用包含ＴａｑＭｉｘ６ｕｌ、模逡逑板ｃＤＮＡ邋１…、ＧＬＲａＶ－３对应特异性上下游引物各０．６邋０、其他引物各０．４山的逡逑１０Ｍ体系。逡逑１９逡逑

逦９７％逡逑３．４．２实时荧光定量检测结果逡逑由图２．４、２．５可以看出，，５月至９月间在调查样本中ＧＲＳＰａＶ、ＧＬＲａＶ－３、逡逑ＧＶＢ、ＧＶＥ、ＧＦｋＶ含量均表现出季节性的变化。检测到的ＧＲＳＰａＶ的最高含量逡逑远高于其他病毒，其含量呈现先上升再下降的变化，在７月达到峰值；０0＾％逡逑３、ＧＶＥ、ＧＦｋＶ同样呈现先上升再下降的变化，在６月达到峰值；ＧＶＢ含量则逡逑是在该期间不断下降。实时荧光定量的定性检测结果与ＲＴ－ＰＣＲ检测结果一致率逡逑为邋７５＿５６％。逡逑－Ａ—ＧＲＳＰａＶ逡逑＿邋１４００逡逑Ｊ邋１２００逦Ａ逡逑汾！－逦／逦＼逡逑Ｓ邋１邋６００逦／逦＼逡逑Ｂ邋５邋４００逦／逦＼逡逑＾逦０逦Ａ逡逑５邋弓／Ｍａｙ逦６月／Ｊｕｎ逦７邋月／Ｊｕｌ逦８邋月／Ａｕｇ逦９邋月／Ｓｅｐ逡逑图２．４邋ＧＲＳＰａＶ实时荧光定量检测结果逡逑Ｆｉｇ２．４邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＰＣＲ邋ｉｎ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＲＳＰａＶ逡逑２１逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.631.1

【参考文献】

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本文编号：2606618