植物病毒细胞间运输通道和GABA_A受体的三维结构研究

发布时间：2020-04-08 08:11

【摘要】：第一部分电子断层三维重构术研究植物病毒细胞间运输的超微结构背景:病毒成功注入宿主细胞是其感染和传播关键步骤。为了实现细胞间转运,病毒可以利用和修饰使植物细胞相连的复杂细胞质桥——胞间连丝。利用胞间连丝进行细胞间转运的病毒需要借助由病毒自身编码的一种或多种运动蛋白辅助,但是胞间连丝的结构和组分都显示其存在尺寸排阻极限。近些年,在水稻的筛管细胞界面上观察到一种柔性的胞间通道——侧向筛域通道,这种胞间通道存在于多种呼肠孤病毒侵染的植物组织中。侧向筛域通道结构类似压缩的胞间连丝,可以容纳直径约80nm的完整病毒粒子,促进病毒在宿主细胞中的转运。目的:建立基于连续切片与多视野拼接的电子断层三维重构成像实验技术流程,解析病毒粒子在植物细胞间运输通道——侧向筛域通道的超微结构,统计分析该通道的不同形态与结构。方法:将水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)感染的水稻组织制备成树脂包埋块,并制备连续半薄切片(～200nm)。利用200kV透射电子显微镜与SerialEM软件进行自动化数据采集,获取目标结构的一系列不同角度的多视野拼接二维投影。进一步使用IMOD软件进行数据的校准、三维重构及连续三维重构数据的叠加;随后利用Amira软件对数据进行人工分割和渲染,并对不同形态类型的通道结构进行统计分析。结果:通过对多套电子断层三维重构数据进行分析发现侧向筛域通道存在关闭和开放两种状态。此外,我们发现了几类不同形态的侧向筛域通道:位于细胞壁边缘、半通状态和贯穿状态。统计发现侧向筛域通道的直径范围在16～137nm,并且在细胞壁中是一个非连续的结构。结论:基于连续切片的电子断层三维重构成像技术能够更加完整的重建侧向筛域通道的三维超微结构,避免了传统基于单张二维投影图像分析可能存在的偏差,为进一步探究病毒侵染宿主提供了结构信息。第二部分人源α5β3γ-氨基丁酸A型受体的冷冻电镜三维重构背景:γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体是半胱氨酸环型配体门控离子通道超家族的一员,快速介导抑制性神经传递,对控制大脑的兴奋性至关重要。功能失调的GABAA受体会引发许多神经疾病和精神疾病。人类GABAA受体通常由19种不同亚基(α,β,γ,δ,ε,θ,π和ρ亚基)组成异五聚体,具有不同亚基组成和排列的受体亚型有不同的生物物理和药理学性质。目的:获得GABAA受体的冷冻电镜结构,探索此类受体的组装原理和GABA配体在α/β亚基界面结合位点及作用机制,通过GABAA受体结构对通道门控机制进行进一步的生物物理分析。方法:使用HEK293-GnTl-细胞过表达人源α5β3 GABAA受体,GABAA受体-Nb25复合物在1mMGABA存在下共纯化,并用于制备冷冻电镜的样品载网,通过冷冻电镜单颗粒分析技术重建其三维结构。结果:获得了α5β3 GABAA受体异五聚体3.51A的冷冻电镜结构,该结构显示一个α亚基和4个β亚基的亚基化学计量组成。并且获得与观察GABA结合在β(+)/α(-)界面处的规范的配体结合“芳香笼”结果一致。结论:GABAA受体在脱敏和开放状态的结构比较揭示了由细胞外和跨膜结构域之间的躯体运动引起的四元激活机制。α5β3 GABAA受体仅含有一个GABA结合位点,代表最简单的异五聚体GABAA受体,为我们进一步对通道门控机制进行生物物理分析提供了参考。
【图文】：

逦植物病毒细胞间运输通道的三维结构研究逡逑的内部核心颗粒直径约５０ｎｍ［２１】（图２．１0。直到２００８年获得了邋ＲＲＳＶ低分辨的逡逑衣壳结构［２２］，结构显示病毒粒子除了塔突外，核心衣壳的直径为５４０邋Ａ邋（图２．２）。逡逑塔突由两部分组成：一个宽度为１５０Ａ、高度为９０Ａ的长塔突，以及长度为７０Ａ、逡逑高度为５５邋Ａ的外围三角翼。这类三聚体在已知的呼肠孤病毒中是ＲＲＳＶ独有的，逡逑并且每个三聚体结合三个钳夹蛋白。逡逑ｍｍｍｒｎ逡逑图２．１用戊二醛固定并用醋酸双氧铀染色的ＲＲＳＶ颗粒的电子显微照片。逡逑Ａ、Ｂ：纯化的病毒颗粒；标尺分别为２００ｎｍ、５０ｎｍ；邋Ｃ：病毒核心颗粒，标尺为逡逑２００邋ｎｍ［２１］0逡逑ｌ＾ＨＢ逡逑图２．２邋ＲＲＳＶ的衣壳结构。逡逑Ａ：邋ＲＲＳＶ表面结构表示；Ｂ：中央横截面。根据距离病毒颗粒中心的距离对地图逡逑进行着色，以此指示颜色编码。核心衣壳：黄色；钳夹蛋白质：绿色；长塔突：位逡逑于五次轴处的蓝色结构；周边三聚体，位于塔突周围的浅蓝色三聚体【２２】。逡逑７逡逑

逦植物病毒细胞间运输通道的三维结构研究逡逑的内部核心颗粒直径约５０ｎｍ［２１】（图２．１0。直到２００８年获得了邋ＲＲＳＶ低分辨的逡逑衣壳结构［２２］，结构显示病毒粒子除了塔突外，核心衣壳的直径为５４０邋Ａ邋（图２．２）。逡逑塔突由两部分组成：一个宽度为１５０Ａ、高度为９０Ａ的长塔突，以及长度为７０Ａ、逡逑高度为５５邋Ａ的外围三角翼。这类三聚体在已知的呼肠孤病毒中是ＲＲＳＶ独有的，，逡逑并且每个三聚体结合三个钳夹蛋白。逡逑ｍｍｍｒｎ逡逑图２．１用戊二醛固定并用醋酸双氧铀染色的ＲＲＳＶ颗粒的电子显微照片。逡逑Ａ、Ｂ：纯化的病毒颗粒；标尺分别为２００ｎｍ、５０ｎｍ；邋Ｃ：病毒核心颗粒，标尺为逡逑２００邋ｎｍ［２１］0逡逑ｌ＾ＨＢ逡逑图２．２邋ＲＲＳＶ的衣壳结构。逡逑Ａ：邋ＲＲＳＶ表面结构表示；Ｂ：中央横截面。根据距离病毒颗粒中心的距离对地图逡逑进行着色，以此指示颜色编码。核心衣壳：黄色；钳夹蛋白质：绿色；长塔突：位逡逑于五次轴处的蓝色结构；周边三聚体，位于塔突周围的浅蓝色三聚体【２２】。逡逑７逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41

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2 湖南日报记者 余蓉 通讯员 粟用湘 胡京s

本文编号：2619110