Q烟粉虱唾液钙结合蛋白的鉴定及初步功能分析

发布时间：2020-04-14 08:34

【摘要】：烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))是一种世界性的农业害虫,主要通过刺吸植物韧皮部汁液、分泌蜜露、传播多种植物病毒等对寄主植物产生直接和间接的危害,进而影响寄主植物的生长发育,对农业生产造成重大的经济损失。钙结合蛋白作为钙信号传导途径的组分,通过与所有真核生物中普遍存在且必不可少的钙离子结合实现其生物学功能,能够调控细胞生命周期与信号传导等过程。植物在感知病原体相关分子模式后,Ca~(2+)升高是植物中最早的信号传导事件之一,钙离子浓度高时筛管分子弥散舒张,堵塞汁液流通,浓度低时筛管分子收缩,汁液顺利流通,钙结合蛋白可以通过降低钙离子浓度来保持昆虫从韧皮部筛管中持续摄取,钙结合蛋白可能在烟粉虱与寄主植物的互作中发挥着重要作用。为明确钙结合蛋白在Q烟粉虱体内发挥的作用,本文对烟粉虱钙结合蛋白的功能进行了初步探索。首先对烟粉虱钙结合蛋白进行了基因克隆、序列分析、系统进化树的构建以及使用亚细胞定位的方法对钙结合蛋白进行细胞定位;然后对钙结合蛋白在烟粉虱不同组织、不同龄期、不同寄主、饥饿诱导取食后不同时间段的表达模式进行了差异分析;最后对钙结合蛋白进行了谷枯菌介导的瞬时表达实验并利用RNAi技术对钙结合蛋白干扰后的烟粉虱的存活率和繁殖力进行了生物测定分析。主要研究结果如下:1、钙结合蛋白的生物信息学分析及定位(1)通过基因克隆的方法得到烟粉虱的钙结合蛋白基因全长。其开放阅读框(ORF)全长序列为669 bp,序列分析显示,烟粉虱钙结合蛋白是一个长为222个氨基酸的蛋白,预测分子量为24.55 kDa,理论等电子点pI为4.64,信号肽为21个氨基酸且不具有跨膜信号。具有EF hand手型保守结构域,在靠近氨基酸序列的C-末端具有钙结合位点。(2)运用MEGE6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)将钙结合蛋白推导出来的氨基酸序列与NCBI已公布的其他昆虫钙结合蛋白的氨基酸序列进行系统进化树的构建。系统进化树的分析结果表明:烟粉虱钙结合蛋白与半翅目昆虫甘蔗黄蚜Sipha flava和高粱蚜Melanaphis sacchari关系最近,分属同支,与鳞翅目昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera、夏威夷红蛱蝶Vanessa tameamea、斜纹夜蛾Spodoptera litura和膜翅目昆虫家蚁Monomorium pharaonis、阿根廷蚁Linepithema humile、蚂蚁Trachymyrmex cornetzi进化关系最远。(3)进行了钙结合蛋白亚细胞定位实验。将钙结合蛋白构入pCAMBIA1300(GFP标签)表达载体,与绿色荧光蛋白(GFP)进行融合表达,转化农杆菌GV3101,进行烟草注射后在激光扫描共聚焦显微镜下观察烟粉虱钙结合蛋白在本氏烟烟草叶片细胞中的亚细胞定位。结果显示,钙结合蛋白定位于烟草的细胞核和细胞膜中。2、钙结合蛋白的表达模式(1)利用荧光定量PCR对烟粉虱不同组织中钙结合蛋白的表达量进行了差异分析。结果表明:钙结合蛋白在烟粉虱体内各个组织中都有表达,在烟粉虱胸、腹、足和翅膀中钙结合蛋白的表达量分别为烟粉虱头中钙结合蛋白表达量的0.5985、0.8529、0.6897和0.5067倍,其中,烟粉虱的头部钙结合蛋白的表达量最高,显著高于其他部位;翅中钙结合蛋白的表达量最低,显著低于烟粉虱其他部位钙结合蛋白的表达量;腹部钙结合蛋白的表达量显著高于胸部、足和翅;胸部与足钙结合蛋白表达量无显著性差异。(2)利用荧光定量PCR对不同发育期烟粉虱钙结合蛋白的表达量进行了差异分析。结果表明:钙结合蛋白在烟粉虱生长发育的各个时期都有表达,其中钙结合蛋白在烟粉虱卵期的表达量最低,显著低于其他龄期,在烟粉虱一二龄、三龄、四龄、成虫期钙结合蛋白的表达量分别为烟粉虱卵期钙结合蛋白的表达量的4.38倍、5.47倍、16.76倍和5.03倍;四龄若虫时期表达量最高,显著高于其他龄期;一二龄、三龄、及成虫期三个阶段烟粉虱钙结合蛋白的表达量之间无显著性差异。(3)利用荧光定量PCR对饥饿诱导取食后不同时间段烟粉虱钙结合蛋白的表达量进行了差异分析。结果表明:经饥饿诱导后取食的烟粉虱钙结合蛋白的表达量显著升高,取食后不同时间点(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、12 h)的烟粉虱钙结合蛋白的表达量均显著高于取食0h的烟粉虱成虫钙结合蛋白的表达量,分别为取食0 h的2.12、1.6291、1.7077、1.9114、1.5438和1.7066倍;取食1 h与4 h时烟粉虱成虫中钙结合蛋白的表达量显著高于其他时间点(0 h、2 h、3 h、5 h、12 h),但二者表达量之间无显著性差异。(4)利用荧光定量PCR对烟粉虱钙结合蛋白在寄主适应性方面的作用进行了初步分析。结果表明:取食辣椒和番茄的烟粉虱钙结合蛋白的表达量略高于取食棉花的烟粉虱钙结合蛋白的表达量,但三者之间无显著性差异。3、钙结合蛋白功能的初步验证(1)利用谷枯菌Burkholderia glumaeⅢ型分泌系统,将构建好的pEDV::Ca~(2+)-binding protein表达载体在烟草中进行瞬时表达。从烟草表型变化可以看出,注射携带pEDV空载的谷枯菌会引起烟草表型的变化,造成烟草叶片的程序性坏死反应,而注射钙结合蛋白的位点也出现了程序性坏死反应,表明钙结合蛋白未能抑制谷枯菌所引起的植物防御反应。(2)进行了钙结合蛋白RNAi干扰引物的筛选。利用荧光定量PCR对设计的4对干扰引物dsCa-F1、dsCa-F2、dsCa-F3、dsCa-F4干扰烟粉虱2天、3天时烟粉虱钙结合蛋白的表达量进行了分析,dsCa-F2干扰3天时干扰效率最高最稳定,因此选择dsCa-F2作为干扰引物,取干扰后3天的烟粉虱雌成虫进行生物测定实验。(3)进行了钙结合蛋白干扰后烟粉虱的存活率测定,将饲喂dsEGFP和dsCa三天的烟粉虱放在番茄苗上取食3天,对烟粉虱的存活率进行分析。结果显示:钙离子结合蛋白被干扰后的烟粉虱的存活率略低于对照dsEGFP的烟粉虱的存活率,但两者之间无显著性差异。(4)进行了钙结合蛋白RNAi干扰后烟粉虱的繁殖力测定,将饲喂dsEGFP和dsCa三天的烟粉虱放在番茄苗上取食3天,对烟粉虱的单雌产卵量进行分析。结果显示:钙离子结合蛋白被干扰后的烟粉虱的单雌产卵量显著低于对照dsEGFP的烟粉虱的单雌产卵量,干扰后的烟粉虱的平均单雌产卵量为9.35粒,而dsEGFP处理的烟粉虱的平均单雌产卵量为12.88粒。
【图文】：

结构图,克隆载体,结构图,吸附柱

吸附柱重新放入收集管中；的 Buffer PB 与 PCR 产物转入吸附柱中，室温静置心 1 分钟，弃废液（吸附柱容纳体积为 750 ul，若入）；0 ul Buffer PW 溶液（使用前检查是否已加入无水温静置 3 - 5 分钟，，13000 rpm 离心 1 分钟，弃废液rpm 空甩 1 分钟，将吸附柱转移至新 1.5 ml 离心管 - 50μl Buffer EB 加入吸附柱中心位置（勿碰到吸附13000 rpm 离心 1 分钟，弃去吸附柱。产物保存于物连接 T 载体进行序列验证受态细胞为全式金 Trans1 - T1 Phage Chemically C pEASY - T1 Cloning Kit，T1 载体结构如图所示

氨基酸序列,钙结合蛋白,序列分析

2.1.11 钙结合蛋白序列分析和进化分析使用 ExPAsyPro-temics Server (http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html) 预测蛋白质的理化性质；使用 SignalP 4.1 软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 进行信号肽预测；跨膜结构域的预测使用 TMHMN2.0.(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；使用 MEGA 6.0 软件采用邻接法(Neighbor - joining)构建系统发育树，各分支均进行 1000 次重复检验。2.2 结果与分析2.2.1 钙结合蛋白的克隆及序列分析通过基因克隆的方法得到烟粉虱的钙结合蛋白基因全长（GenBank 登录号为XP_018909727.1）（图 2-2）。其开放阅读框（ORF）全长序列为 669bp，序列分析显示，烟粉虱钙结合蛋白是一个长为 222 个氨基酸的蛋白，预测分子量为 24.55kDa，理论等电子点 pI 为 4.64。使用 SignalP4.1 及 TMHMN2.0 预测其信号肽为 21个氨基酸且不具有跨膜信号。在靠近氨基酸序列的 C - 末端具有钙结合位点。
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.3

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