水稻病原诱导元件AATCA及其互作转录因子的功能鉴定
发布时间：2020-05-05 21:07
【摘要】：水稻是世界上重要的粮食作物。由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻纹枯病是极具破坏性的水稻病害之一。目前水稻病害研究大多集中在白叶枯病和稻瘟病上,很少有针对纹枯病的相关研究。而对水稻纹枯病的抗病机制与调控机理的研究更是少之又少。当前生产上主要是通过培育种植抗病品种来防治作物病害。但由于水稻对纹枯病的抗性是数量性状,所以很难通过常规育种手段来产生高抗纹枯病品种。纹枯病高抗材料的缺乏限制了其抗性育种。因此研究调控抗病相关基因表达的启动子及其互作转录因子进行抗病育种是防治水稻纹枯病的有效策略。前期实验室研究发现,水稻基因Os2H16能够被纹枯病菌所诱导,超量表达Os2H16增强了水稻对纹枯病菌的抗性,抑制表达Os2H16会使水稻对纹枯病菌更加敏感。Os2H16基因启动子是能够被纹枯病菌诱导的病原诱导表达型启动子,并且已经鉴定到了该启动子的主要响应区域为-513 bp至-411 bp以及-411 bp至-309 bp。前期通过烟草瞬时表达系统研究发现一个新的存在于-513 bp至-411 bp区域的能够独立响应纹枯病菌的顺式元件AATCA。本研究通过将AATCA元件转入水稻中进行表达发现其可以响应纹枯病菌的诱导,验证了前期实验室在烟草瞬时表达中的结果。我们通过DNA pull-down技术筛选得到与AATCA元件互作的蛋白。随后运用酵母单杂交技术验证了AATCA元件与OsbHLH057蛋白的互作。通过对OsbHLH057基因进行分析发现其编码一个功能未知的蛋白,具有HLH保守结构域,且定位于细胞核。对OsbHLH057基因的病原诱导表达模式进行分析,发现其可以受纹枯病菌诱导表达,暗示它可能参与水稻对纹枯病菌的响应。然后我们还构建了OsbHLH057基因超量与基因编辑表达载体,获得了水稻超量植株和敲除突变体植株,并且检测了其下游抗病相关基因Os2H16的表达,发现在敲除突变体中该基因表达均有一定程度的下调,表明OsbHLH057基因可能通过影响Os2H16的表达来正调控水稻对纹枯病的抗性。终上所述,本研究对顺式作用元件AATCA及其互作转录因子OsbHLH057进行研究,为利用调控抗病基因的表达,来提高水稻纹枯病抗性的研究提供了新的理论基础,对进一步研究水稻对纹枯病的抗性机制以及培育抗性水稻品种具有重要的意义。
【图文】：
Os2H16也进行研究，通过截短发现两个受诱导的核心区间-513到-411与-411到-309，其中-513到-411中存在一个新的病原诱导元件。该元件位于启动子区域-508 bp 至-503 bp，其序列为 AATCA，能够在烟草中响应纹枯病菌的诱导。为了鉴定 AATCA 元件及其互作转录因子的功能，本课题进行了以下研究：3.1AATCA 元件病原诱导活性的功能验证之前的启动子缺失实验已经证实在烟草中AATCA元件能够响应纹枯病菌YWK196的诱导。为了验证在水稻中 AATCA 元件能否被病原菌诱导，我们构建了 AATCA 元件重复序列的 35S minimal 启动子表达载体 2×AATCA-35S mini-GFP，并以空载体为对照，分别转入水稻中花 11。获得转基因植株后，对其接种 YWK196 18 h 后检测 GFP 表达强度。结果发现转有空载体的水稻中，接种与不接种 GFP 信号强度相似，基本检测不到GFP 荧光的表达，而转有 AATCA 元件的水稻在接种后表现出很强的荧光信号（图 1A）。进一步利用 GFP 定量分析发现，其与观察结果完全一致（图 1B）。这一实验验证了前期烟草上瞬时表达的结果，说明 AATCA 元件能够响应 YWK196 的诱导。
3.3AATCA 与 OsbHLH057 在本生烟中的共表达分析为了验证 OsbHLH057 基因能否激活 AATCA 元件的表达，我们克隆了 OsbHLH0的 cDNA 序列，然后将其连入 pCXUN-Myc 载体，并构建 POs2H16启动子全长、POs2H启动子全长缺失 AATCA 元件和 AATCA 的 GFP 载体（图 3A）。然后分别将 POs2H16动子全长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 AATCA 与 OsbHLH057-pCXUN-M在本生烟叶片中共同瞬时表达，以 pCXUN-Myc 空载体为对照。结果表明，空载体POs2H16启动子全长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 同注射的烟草叶片中均检测不到荧光信号，而同时转有 OsbHLH057 与 POs2H16启动子长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 的烟草叶片中可检测到 GFP 的表达，其中全长启动子缺失 AATCA 元件后荧光信号减弱（图 3B，3C）说明 OsbHLH057 在植物体内可以与 AATCA 元件结合并激活 AATCA 的表达，，且可以活 POs2H16启动子不仅仅是依赖 AATCA 元件。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.42
本文编号：2650753
【图文】：
Os2H16也进行研究，通过截短发现两个受诱导的核心区间-513到-411与-411到-309，其中-513到-411中存在一个新的病原诱导元件。该元件位于启动子区域-508 bp 至-503 bp，其序列为 AATCA，能够在烟草中响应纹枯病菌的诱导。为了鉴定 AATCA 元件及其互作转录因子的功能，本课题进行了以下研究：3.1AATCA 元件病原诱导活性的功能验证之前的启动子缺失实验已经证实在烟草中AATCA元件能够响应纹枯病菌YWK196的诱导。为了验证在水稻中 AATCA 元件能否被病原菌诱导，我们构建了 AATCA 元件重复序列的 35S minimal 启动子表达载体 2×AATCA-35S mini-GFP，并以空载体为对照，分别转入水稻中花 11。获得转基因植株后，对其接种 YWK196 18 h 后检测 GFP 表达强度。结果发现转有空载体的水稻中，接种与不接种 GFP 信号强度相似，基本检测不到GFP 荧光的表达，而转有 AATCA 元件的水稻在接种后表现出很强的荧光信号（图 1A）。进一步利用 GFP 定量分析发现，其与观察结果完全一致（图 1B）。这一实验验证了前期烟草上瞬时表达的结果，说明 AATCA 元件能够响应 YWK196 的诱导。
3.3AATCA 与 OsbHLH057 在本生烟中的共表达分析为了验证 OsbHLH057 基因能否激活 AATCA 元件的表达，我们克隆了 OsbHLH0的 cDNA 序列，然后将其连入 pCXUN-Myc 载体，并构建 POs2H16启动子全长、POs2H启动子全长缺失 AATCA 元件和 AATCA 的 GFP 载体（图 3A）。然后分别将 POs2H16动子全长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 AATCA 与 OsbHLH057-pCXUN-M在本生烟叶片中共同瞬时表达，以 pCXUN-Myc 空载体为对照。结果表明，空载体POs2H16启动子全长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 同注射的烟草叶片中均检测不到荧光信号，而同时转有 OsbHLH057 与 POs2H16启动子长、POs2H16启动子全长缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 的烟草叶片中可检测到 GFP 的表达，其中全长启动子缺失 AATCA 元件后荧光信号减弱（图 3B，3C）说明 OsbHLH057 在植物体内可以与 AATCA 元件结合并激活 AATCA 的表达，，且可以活 POs2H16启动子不仅仅是依赖 AATCA 元件。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.42
【参考文献】
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本文编号：2650753
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