【摘要】：太子参(Pseudostellariae heterophylla(Miq.)Pax et Hoffm)是一种药食两用的草本植物,近年来,随着太子参中药用活性成分的开发利用,以太子参为原料的保健品产品日益增多,极高的应用价值和商业价值使得其得到广泛的关注,而真菌病害的暴发已经严重影响太子参的产量及品质。固定化微生物技术是一种易于控制生物浓度、保护菌种、减少菌种的流失的重要生物防治措施。本文从实验室已筛选获得的枯草芽孢杆菌JK05对太子参叶斑病病原菌斑点叶点霉的拮抗作用出发,研究了JK05代谢产生的拮抗活性物质,复合材料固定化JK05生防小球的制备工艺,以及固定化生防小球的施用对太子参品质的影响等,研究结果对太子参叶斑病等真菌病害的防治具有重要意义。论文主要研究成果如下:(1)对枯草芽孢杆菌JK05的拮抗活性物质进行了纯化和鉴定。初步确定枯草芽孢杆菌JK05的拮抗活性物质为蛋白质成分,采用硫酸铵沉淀法对胞外发酵液进行沉淀,在硫酸铵饱和度为40~60%范围之间沉淀析出的粗蛋白具有显著的拮抗活性,粗蛋白的拮抗活性随热处理温度的升高而降低,在30~80℃范围内变化不显著(P0.05),当温度高于80℃时,则显著降低(P0.05),但依然具有较高的拮抗活性,即拮抗蛋白粗提物具有良好的热稳定性;粗蛋白的拮抗活性在pH过低(pH 4)或pH过高(pH 10)的条件下显著降低(P0.05),pH 5~9范围之间的酸碱处理对其影响不显著(P0.05)。40~60%粗蛋白经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和SepadexG-100凝胶层析,洗脱获得1个蛋白组分,其在SDS-PAGE图谱上显示为单一条带,且该纯化蛋白经对峙培养结果显示具有显著拮抗活性,将其编号为BSAP。经LC-MS/MS分析,初步将枯草芽孢杆菌JK05的拮抗活性蛋白BSAP鉴定为二氢硫辛酰胺脱氢酶。傅里叶红外光谱扫描显示,拮抗活性蛋白BSAP由于C=O键在平面内伸缩振动,在酰胺Ⅰ带1631.028cm~(-1)处有特征吸收峰,属于β-折叠结构;由于C—N键反对称伸缩振动和N—H键平面内弯曲振动,在酰胺Ⅲ带1296.915 cm~(-1)处有特征吸收峰,属于α-螺旋结构。(2)利用固定化微生物技术将枯草芽孢杆菌JK05包埋制备获得太子参叶斑病生防小球。以生防小球的机械性能、传质性能以及拮抗活性为指标,确定了生防小球最佳的复合载体材料组合为9%聚乙烯醇、3%海藻酸钠和2%活性炭,生防小球的最佳包埋芽孢浓度为2?10~8 cfu/mL。扫描电子显微镜(SEM)结果显示,生防小球内部孔隙丰富发达,孔隙内部聚集大量JK05,且菌体结构完整、形态饱满。在15~24℃范围内,生防小球的拮抗活性随着温度的升高而增强,具有显著性差异(P0.05),当上升到24℃时,小球的拮抗活性达到最大值45.75%,当温度达到27℃时则降低,但与24℃时相比差异不显著(P0.05);pH 4~8之间,生防小球具有较好的拮抗活性。风干生防小球在制备完成后的60 d内其相对生物活性较稳定,相对生物活性大于80%;保存时间延长至120 d,生防小球的相对生物活性为60%以上。(3)以太子参主要化学成分的变化为指标,分析获得了栽培过程中施用生防小球对太子参品质的影响:太子参多糖含量显著提高(P0.05),多糖含量在施加剂量为0.1 g/株时达到最大值12.49%;水分含量、皂苷含量和灰分含量无明显变化(P0.05);施加生防小球会降低太子参内Fe和Mn元素含量,对Mg、Rb、Co等3种元素含量无影响,能提高K、Ca、Zn、Cu等4中元素含量;挥发性成分种类有所提高;氨基酸中仅蛋氨酸含量有所下降,其它各氨基酸与对照组基本一致。
【图文】：
将微生物细胞固定达到固定化的目的；该固定化方法结合强稳定性，，但反应过程激烈，导致微生物活性大大降低且一般交其在实际应用中较为少见[77]。Iype[78]等人通过环氧氯丙烷将定到无涂层氧化铁纳米颗粒上，根据此方法还固定了酶，如辣酶，不损害固定化蛋白质的活性还提高了酶的稳定性。是通过聚合作用或形成离子网络将微生物细胞截留在多孔载空间中，凝胶的网络结构在截留细胞的同时能让底物渗入和细来；该固定化方法操作简单、成本低、反应相对温和且制备的强度高，是目前固定化微生物最常用的方法[79]。Hahn-H[80]等和酿酒酵母包埋固定在海藻酸钙凝胶中生产乙醇，固定化生物的运行过程中，产率没有下降。
Fig. 2.1 Antagonistic activity of supernatant fraction and protein precipitation after precipitationwith ammonium sulfate从图2.1可以看出，在粗蛋白作用下，病原菌菌落的生长受到了明显的抑制，而滤液上清部分未出现拮抗现象，即枯草芽孢杆菌 JK05 发酵液中的蛋白成分对供试病原菌斑点叶点霉具有显著拮抗效果，因此初步判断拮抗菌 JK05 的拮抗活性物质为蛋白质成分。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.675;TB33
【参考文献】
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