lncR-6496和lncR-26319在家蚕变态发育过程中表达谱及功能初探

发布时间：2020-05-18 19:16

【摘要】：非编码RNA(ncRNA)是一大类无蛋白编码能力的RNA的总称,在基因表达调控过程中发挥着重要作用。微小RNA(microRNA,miRNA)与长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是两大主要类群,它们介导了转录、转录后及翻译等多个层次的基因表达调控。一些lncRNA可以作为miRNA前体发挥作用,另外一些lncRNA可以作为miRNA的竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)发挥作用。本课题在实验室前期构建的家蚕lncRNA文库的基础上,选择两个lncRNA,一个可以作为miRNA的前体产生多个miRNA,一个与miRNA序列互补作为竞争性内源RNA,研究miRNA与lncRNA在家蚕变态发育过程中的调控机制。为利用lncRNA和miRNA对家蚕进行转基因改良提供理论依据。本课题首先研究了lncRNA、miRNA及miRNA靶基因在家蚕不同发育时期及不同组织中的表达谱,研究三者之间的互作关系。其次通过家蚕个体及细胞实验探索lncRNA通过miRNA参与家蚕变态发育的分子机制。主要研究结果如下:1.lncRNA与miRNA在家蚕变态发育过程中的表达谱。以家蚕变态发育不同阶段的总RNA为研究对象,利用实时荧光定量PCR的方法,研究lncR-6496、lncR-26319、miR-2817和miR-2834在家蚕变态发育过程中的表达谱。结果表明,与miR-2817和miR-2834产生于同一基因座位的lncR-6496与两个miRNA在家蚕变态发育过程中存在着一致的表达趋势,在幼虫发育阶段,表达趋势不明显;在成虫及蛹发育阶段,呈现先下降后上升的趋势。产生于miR-2817和miR-2834互补链的lncR-26319与两个miRNA在家蚕变态发育过程中存在着相反的表达趋势,在幼虫阶段lncR-26319表达量先减少再逐步增加,到5龄时达到最高;两个miRNA二龄时最高,随后逐渐下降;在蛹及成虫阶段lncR-26319呈现先上升后下降趋势,两个miRNA呈现先下降后上升的趋势,表明这些lncRNA可能通过miRNA参与家蚕变态发育。2.lncRNA与miRNA在家蚕不同组织中的表达谱。两个lncRNA和两个miRNA的趋势相同,在家蚕的大脑、精巢和中肠中表达量比较高,在马氏管、丝腺、血淋巴和脂肪中表达量较低。大脑、精巢和中肠是功能和结果比较复杂的组织,lncRNA和miRNA在其中可能扮演着重要的角色。3.lncR-26319、miR-2834与靶基因endophilin A在家蚕蛹期表达谱。通过生物信息学预测的靶标基因,结果发现家蚕内吞蛋白endophilin A的3’-UTR与miR-2834的种子序列匹配较好,可能是miR-2834的真实靶标。endophilin A是内吞蛋白,在家蚕变态发育过程中具有重要的作用,endophilin A基因突变会导致细胞自噬不能正常发生,自噬是家蚕化蛹过程中的必经步骤,自噬功能的缺失将导致家蚕变态发育异常。为进一步验证二者是否存在真实的互作关系,我们在家蚕蛹期检测lncR-26319、miR-2834和靶标基因endophilin A的表达谱。结果显示,lncR-26319和miR-2834表达趋势相反,和靶标基因endophilin A表达趋势一致,均呈现发育前期低后期高的趋势,表明lncR-26319可能作为miR-2834海绵抑制miRNA的表达。4.体外实验验证miRNA和靶标基因的互作关系。我们首先构建endophilin A3’-UTR的过表达载体psiCHECK-endophilin A。其次,在HEK293细胞系中共转染miR-2834 mimics和psiCHECK-endophilin A,通过双荧光素酶报告基因系统检测miR-2834和endophilin A的互作关系。结果表明,miR-2834过表达可以造成靶标基因psiCHECK-endophilin A的荧光素酶活性降低40%以上,差异极显著,表明endophilin A是miR-2834的真实靶标。本研究首次发现miR-2834可以靶向修饰自噬相关蛋白endophilin A,表明miR-2834可能在家蚕变态发育过程中发挥重要作用。该研究结果为利用miRNA及lncRNA参与家蚕变态发育提供了良好的前期基础,为家蚕的转基因改良提供了理论依据。
【图文】：

lncR-6496 和 lncR-26319 在家蚕变态发育过程中表达水平的研究及功能初探第三章 结果与分析3.1 lncR-6496 及其产生的 miRNA 在家蚕变态发育过程的表达谱lncR-6496 是实验室在前期转录组测序中获得的家蚕新的 lncRNA。lncR-6度为 833 个核苷酸，在 lncR-6496 同一基因座位上可以产生两个 miRNA，miR和 miR-2834。三者位置关系如图 1 所示，由图可见 miR-2734 前体 63 个核苷酸于 lncR-6496 第 386 到 448 位处。miR-2817 前体长度为 66 个核苷酸，位于 lncR第449到514位处。miR-2734和miR-2817之间没有间隔。成熟的miR-2834和miR产生于其前体序列的 5' 端。

图 3-2 lncR-6496、miR-2817 和 miR-2834 在家蚕幼虫期表达量ig 3-2 Expression levels of lncR-6496, miR-2817 and miR-2834 in silkworm、3L2D、4L2D 和 5L3D 分别代表家蚕的一龄 2 d、二龄 2 d、三龄 2 d代表龄期，D 代表天数。 3L2D, 4L2D and 5L3D respectively represent the first 2 d, the second 2 d and the fifth 3 d of silkworm, L stands for age and d stands for days.蛹期可直接区分雌雄，，所以我们在家蚕蛹期取了雌雄蛹的 miRNA 的表达谱。在研究的初期我们选取家蚕雌雄化蛹期的果如图 3-3 所示，由图可见，lncR-6496 在家蚕的雌蛹中呈现在化蛹 1 天和 5 天时表达量较高，化蛹 2d 出现一个低谷。lnc势与雌蛹一致。而到达成虫阶段后，雌蛾中 lncR-6496 的表达量表达量则急剧减少。表明 lncR-6496 在家蚕雌雄蛹的变态发育但在雌雄蛾中可能发挥不同的作用机制。lncR-6496产生的两个miRNA而言，二者表达趋势与lncR-649
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S881.2

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1 邱妩洁;lncR-6496和lncR-26319在家蚕变态发育过程中表达谱及功能初探[D];南阳师范学院;2019年

本文编号：2670199