桃蚜浓核病毒基因组特征及表达分析

发布时间：2020-05-19 19:18

【摘要】：2003年,国际上首次从荷兰的桃蚜(Myzus persicae)分离获得桃蚜浓核病毒并测定了该病毒的部分基因组序列。目前,关于桃蚜浓核病毒的进化关系与侵染分子机理所知甚少。在早先获得桃蚜浓核病毒杨凌株系(MpDV-YL)基因组编码序列的基础上,我们又扩增获得了桃蚜浓核病毒云南株系的基因组编码序列(MpDV-YN),并分析了其序列特征及桃蚜浓核病毒进化关系。此外,我们检测了桃蚜浓核病毒在桃蚜及桃蚜寄主植物中的表达和复制情况,研究结果如下:1、根据已获得的MpDV-YL基因组序列设计重叠PCR引物。采用PCR从采自云南省昆明地区的桃蚜中扩增获得大小为5483bp的桃蚜浓核病毒片段。序列分析表明,该基因组与MpDV-YL基因组编码策略一致,即正义链含有两个ORF(ORF1和ORF2),预测编码非结构蛋白NS1和NS2,而反义链含有两个ORF(ORF3和ORF4),预测编码结构蛋白VP1和VP2,该结果进一步显示中国国内的桃蚜浓核病毒与桃蚜浓核病毒荷兰株系的编码策略不同;2、采用定量PCR检测MpDV-YL在桃蚜幼虫的头部、肠道、胚胎及表皮组织中的复制。结果表明,桃蚜浓核病毒在蚜虫肠道内的拷贝数极显著高于在其它组织中,揭示该病毒主要在蚜虫的肠道内复制;3、采用定量PCR检测MpDV-YL预测的NS1、NS2、VP1、VP2编码基因在蚜虫体内及幼蚜头部、肠道、胚胎及表皮组织中的转录水平。结果表明,VP1编码基因在蚜虫体内的转录水平极显著高于其它基因的表达水平;同时,各基因均在蚜虫肠道内存在较高的转录水平;4、为了检测桃蚜浓核病毒能否在桃蚜寄主植物体内转运,我们检测了感染MpDV-YL桃蚜取食寄主(辣椒和甘蓝)后这两种植物叶片、茎、根中MpDV-YL的复制情况。定量PCR结果显示,MpDV-YL在两种植物叶片中的基因组拷贝数显著高于其它组织;进一步分析表明,经DNase I处理后,两种植物叶片中MpDV-YL含量极显著降低,推测在桃蚜寄主植物叶片中存在的MpDV-YL可能来源于叶片表面蚜虫蜜露的污染;5、构建了的MpDV-YL VP1和VP2基因的瞬时表达质粒并转染草地贪夜蛾Sf9细胞。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)检测结果表明VP1与VP2之间可能不存在相互作用;随后,构建了6×His融合的VP1和VP2瞬时表达质粒并转染Sf9细胞。Western blot检测结果表明,VP1和VP2在Sf9细胞中都表达了预期大小的蛋白,推测这两个蛋白未发生剪切。综上所述,国内存在的桃蚜浓核病毒基因组编码策略可能与已发现的桃蚜浓核病毒荷兰株系存在较大差异,而该类病毒在无脊柱动物细小病毒的进化中可能单独作为一个分支。桃蚜浓核病毒主要在蚜虫肠道内复制,该类病毒可能不能通过蚜虫取食而进入桃蚜植物组织并发生转运。上述结果为进一步研究桃蚜浓核病毒侵染机理奠定了一定基础。
【图文】：

示意图,基因组结构,示意图,桃蚜

包括 5 个 ORF，位于正义链的 5’-端的 3 个 ORF 分NS2（225 aa）、NS3（698 aa），，位于反义链 5’-端的 2 个 ORF 可编分别为 57 kDa、64 kDa、68 kDa、85 kDa、92 kDa（图 1-1）（Va。年，本实验室在陕西省杨凌地区的桃蚜中检测到了一种桃蚜浓核病毒杨凌株系，MpDV-YL），并对其基因组进行了分析，结果发现为 5483 个碱基，位于基因组正义链 5’-端的两个 ORF 分别编码 3蛋白；反义连 5’-端的两个 ORF 分别编码大小为 193 aa 和 721 aa 的DV-YL 的桃蚜接种于 7 叶期的辣椒叶片上，结果在辣椒根、以及茎中均未检测到桃蚜浓核病毒，初步表明 MpDV-YL 在桃蚜寄主（王哲，2016）。MpDV-NL 感染蚜虫后可导致蚜虫的发育历期延长、体重减轻、繁et al. 2009; van Munster et al. 2003a）。

示意图,基因组结构,示意图,蚜虫

图 1-2 MpnDV 基因组结构示意图（Song et al. 2016）Fig. 1-2 Schematic presentation of the genomic organization of MpnDV白框，表示外显子；黑框，表示内含子粉红裂蚜浓核病毒（DplDV）红裂蚜浓核病毒（DplDV），基因组由 4979 个碱基组成（GenBank ac1），病毒粒径为 22 nm，包含 4 个 ORF，其中，正义链 5’-端的 2 个（710 aa）和 NS2（414 aa），而反义链则可能含有两个 ORF 编码 VPabov et al. 2009）。V 感染后导致蚜虫繁殖率显着降低，且诱导有翅蚜产生，促进寄主更物，有利于蚜虫种群扩散；值得注意的是，感染 DplDV 的蚜虫可以感病若蚜，这使得在新植物定植后能够产生无病毒繁殖系。（Ryabov ter et al. 2003a）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.13

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