黄单胞菌属DNA条形码筛选及其重要致病变种检测技术研究

发布时间：2020-05-20 02:30

【摘要】：黄单胞菌属是最为重要的植物病原细菌属之一,能够危害多种重要的粮食及经济作物,其中有14种为我国检疫性有害生物。由于属内成员数目众多,种下又分为许多致病变种,致使该属种及种下阶元的鉴定存在很大困难。DNA条形码技术是一种利用特定的DNA序列来鉴定物种的分子生物学技术,具有准确、快速、高通量等优点,可以很好地满足口岸检疫及植保机构的工作需求。因此,为了提高在种及种下阶元上准确鉴定黄单胞菌的能力,本研究开展了黄单胞菌属DNA条形码技术研究;同时为了提高该属内一些重要致病变种的精准鉴定能力,我们还针对其开展了数字PCR检测方法研究。(1)黄单胞菌属DNA条形码基因筛选以327株不同种或致病变种的黄单胞菌为实验材料,基于进化树法及遗传距离法等分别对16S rRNA基因,cpn60,avrBs2,hrp,hpaA,gyrB和rpoD这7个候选条形码基因进行了筛选验证及有效性评价。研究结果表明cpn60基因的PCR扩增与测序成功率都要明显优于其他候选基因。基于其构建的系统发育树也显示该基因对黄单胞菌属种及种下阶元的区分鉴定能力最为理想。同时在barcoding gap分析和best close match测试中该基因也都表现的最为出色,其种/致病变种间遗传距离明显大于种/致病变种内遗传距离,而且对不同种/致病变种的鉴定正确率达到了99%以上,是理想的用于区分鉴定黄单胞菌的条形码基因。(2)黄单胞菌属DNA条形码检测体系的建立及应用基于筛选出的DNA条形码基因及研究获得的大量序列数据,建立了黄单胞菌属DNA条形码检测技术体系。同时利用该体系和多种传统鉴定方法对收集到的疑似黄单胞菌分离物及病害样品进行了应用验证与比较分析,结果显示多种检测方法得到的结果均保持一致,但相比之下,DNA条形码检测方法的鉴定结果准确度更高,操作过程也更为简便快速,易于推广。(3)黄单胞菌属重要致病变种检测技术研究以水稻细菌性条斑病菌、水稻白叶枯病菌以及它们的近缘菌为研究对象,分别基于细菌性条斑病菌的假定膜蛋白基因和白叶枯病菌的rhs家族基因建立了这两种病原菌的特异性数字PCR检测体系。对方法的特异性、灵敏度及重复性进行了测试,并用模拟带菌水稻种子及真实种子样品进行了检测验证。结果表明,所建立的两种方法均能特异性的检测出目标菌株,且均具有较高的灵敏度及良好的重复性,在模拟带菌种子及自然带菌种子样品的应用验证中也都得到了满意的结果。总之,本研究为黄单胞菌属种及种下阶元的准确鉴定提供了新的可靠的分子识别方法,对提高该属有害生物的鉴定能力,保护国内农业和生态安全具有重要的意义。
【图文】：

基于hpaA基因网上序列构建的邻接树

（5'-3'） PCR 扩增程序 GGTTTTCCCAGTCACGACGACGGTGACGGCACCACCAC94°C 5 min；94°C 30 s57°C 30 s，72°C 45 s，，个循环；72°C 10 minATAACAATTTCACACAGGACGACCGAAGCCCGGGGCCTTGGTTTTCCCAGTCACGACGGACTGCCGGTGTTGATGCACGA94°C 2 min；94°C 1 mi60°C 1 min，72°C 1 mi35 个循环；72°C 7 minATAACAATTTCACACAGGACCGCGGTGATCGGTCAACAGGCTTTCGGTTTTCCCAGTCACGACTCCTCCTGTTGT94°C 5 min；94°C 40 s55°C 40 s，72°C 1 min35 个循环；72°C 10 mATAACAATTTCACACAGGAGATCATTTCTCCCGGTTTTCCCAGTCACGACGGATGACGACGA94°C 5 min；94°C 30 s55°C 30 s，72°C 1 min35 个循环；72°C 10 mATAACAATTTCACACAGGATGCGTCCTGAGC00 bp
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.42

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本文编号：2671884