转药用野生稻抗逆相关TAC克隆的水稻抗瘟性研究

发布时间：2020-05-20 20:42

【摘要】：本研究利用华南农业大学以日本晴为受体转化药用野生稻抗逆相关TAC克隆获得的栽培稻材料,包括:1、转化随机TAC克隆获得的高世代(T10)TDF系列稳定株系和低世代(T3-T5)TR系列材料;2、转化基于DREB保守序列筛选的TAC克隆高世代(T10)D系列稳定株系;3、分别转化基于NBS-LRR、STK和NAC保守序列筛选的TAC克隆获得的低世代(T3-T5)NBS-LRR系列材料、STK系列材料和NAC系列材料;通过转化株系目标TAC克隆的分子标记鉴定、稻瘟病菌株抗性鉴定和抗性遗传分析,以期明确转化株系的稻瘟病抗性水平与抗性遗传基础,为进一步挖掘利用药用野生稻抗性基因,培育抗瘟水稻品种奠定基础。主要研究结果如下:人工接种D系列叶瘟鉴定30个D系列株系对55个菌株均有抗性,其中有14个广抗谱株系,抗性水平较高,抗谱比例为65.4%~86.7%,占鉴定总株数的46.67%,16个中抗谱株系,抗谱比例为42.6%~63%;人工穗瘟接种26个D系列株系,8个株系抗谱范围广,抗谱比例为66.7%~85.7%,抗穗瘟能力强,4个中抗谱材料的抗谱比例为40.0%~60.0%,D40株系抗穗瘟能力最弱。选取14个经鉴定抗病性强的D系列株系经田间病圃自然诱发,6个株系抗叶瘟表现0~2级。13个株系抗穗瘟表现0~2级,其中D4-2×LTH表现高抗穗瘟,抗病等级为0级。15个TDF系列株系对55个菌株均有抗性,其中6个广抗谱株系,抗叶瘟能力强,9个中抗谱材料,占总鉴定株数的65.67%,但TDF12株系较弱;TDF株系对穗瘟接种的菌株抗性存在差异,其中7个株系对GD09-3全抗病,5个株系对HB6全抗病;对GW3、FJ3和SH4表现为部分抗病,抗/总株数≥0.71。NBS-LRR系列株系对接种的8个菌株抗叶瘟性存在差异,其中有112个株系对HB1菌株抗性最强,抗病平均等级≤1级,83个株系对GD09-12菌株表现出较高抗性,对GW6、HB5、HB6、jj01-1和FJ10菌株表现出抗瘟性,抗/总株系数≤0.75。STK系列对GW6、GW3、HB4、FJ10菌株表现高抗叶瘟性,抗/总株数比范围:0.54~0.83,但对jj01-1菌株没有抗叶瘟性,均表现为感病。NAC系列株系对GW6和GD09-12菌株的抗叶瘟性较强,抗/总株系数0.79,对HB8、HB4和HB6菌株有一定的抗性,接种HB5、jj01-1、HB1和FJ10菌株感病株系较多,抗/总株系数较小。利用TAC载体携带的HPT和SacB抗性标记基因对30个D系列和12个TDF系列进行抗性检测,均能扩增出目标TAC载体携带的目的基因条带。35个T3代NBS-LRR系列株系,有16个株系扩增出目的条带;100个T4代株系,有92个株系材料扩增目的条带;筛选出74个株系纯合株系,182个T5代株系,有170个株系扩增出目的条带,筛选出159个纯合株系。76个T3代STK系列株系,有15个株系扩增出目的条带;45个T4株系,有37个株系扩增出目的条带,纯合株系有11个;54个T5代株系,45个株系扩增出目的条带,筛选出39个纯合株系。38个T3代NAC系列株系,有13个株系扩增出目的条带;45个T4代株系,均能扩增出目的条带,纯合株系有45个;36个T5代株系,34个株系扩增出目的条带,筛选出31个纯合株系,表明5个选用基于转录因子保守序列筛选的药用野生稻TAC克隆转化水稻株系,从T3至T5代筛选出的纯合抗病株系逐渐增加,T5代基本上达到纯合,均表现出较好的抗病能力,并且抗性趋于稳定,鉴定出目的基因数量逐渐增加,DREB、STK、NBS-LRR和NAC类转录因子分别成功转入这几个转基因株系中,可能作为正向调控因子参与转基因株系的广谱抗病效应,促进其抗稻瘟病能力显著增强。筛选高世代稳定抗病转基因株系D1、D4-1、D4-2和D38与LTH配组鉴定F_2。以HB5菌株接种D1×LTH和D4-1×LTH、以HB8菌株接种D4-1×LTH和D4-2×LTH,对叶瘟的抗感分离比符合3:1,表明D1、D4-1和D4-2对上述菌株的叶瘟抗性受1对显性基因或显性QTL位点控制;以HB8接种D1×LTH,对叶瘟的抗感分离比符合15:1,表明D1对HB8菌株的叶瘟抗性受2对显性基因控制;以HB5菌株接种D4-2×LTH,抗感分离比符合13:3;以HB5和HB8菌株分别接种D38×LTH,抗感分离比均符合9:7;这表明D4-2对HB5菌株、D38对HB5和HB8菌株的叶瘟抗性均与两对互作基因控制有关。以HB5菌株和HB8菌株接种D1×LTH、D4-1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH,穗瘟的抗感分离比符合3:1,表明D1、D4-1和D4-2和D38对上述菌株的叶瘟抗性受1对显性基因或显性QTL位点控制。D1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH均能特异性扩增目标TAC克隆HPT目的基因条带,抗感分离比符合9:7,但L4-1×LTH无理想的抗感分离比,表明D1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH抗病性可能被2对相补的基因控制。
【图文】：

病斑,叶瘟,等级

人工喷雾接种：排查孢子量多的培养皿，，加入双蒸水，再将过滤好的孢子悬浮液，孢子浓度设置为 2×105/L，在显微镜下观察，每个视野有 70～100 个孢子悬浮液，加入一滴吐温 20，利用小型喷雾器均匀地喷洒在叶片上。接种完成后，将水稻盆转移至大泡沫箱中，盖上盖子和遮光布，黑暗处理 24～36 小时，用透明膜盖住泡沫箱，期间早、中、晚洒水以保持水稻叶片的湿度。2.2.6 孕穗期穗瘟人工注射接种方法人工注射接种：采用与苗期人工喷雾接种相同的方法一致。在水稻孕穗初期时，每穗注射 2ml 孢子悬浮液，待水稻成熟后调查病情。注：接种期间最佳温度在 21-23C°，阴天接种好过晴天接种，傍晚接种好过白天接种。2.2.7 叶瘟的病害调查及统计人工喷雾接种叶瘟一周后便可调查并统计各个系列品种的发病情况，根据水稻叶面病斑的大小及性状可将水稻的发病情况分为 6 个等级，具体标准参照Mackill and Bonman 报道[71]的鉴定方法（图 1、表 2）进行。

抗性基因,PCR扩增

图 2 部分 D 系列抗性基因 HPT 的 PCR 扩增结果Fig. 2 The results of pcr amplification part D series resistance gene HPT注：M：DL2000 DNAMarker；泳道 1：日本晴（下同）；泳道 2-24 分别为 D1、D3-1、D3-2、D4、D4-1、D4-2、D6、D11、D14、D19、D22、D22-2、D23、D24、D26、D30、D31、D32、D36、D38、D41、D42。Note: M：DL2000 DNAMarker; Lane 1: Oryza．Sativa L．spp．japonica，var Nipponbare，AA genom(The samebelow).图 3 部分 D 系列抗性基因 SacB 的 PCR 扩增结果Fig. 3 The results of pcr amplification part D series resistance gene SacB注：M：DL2000 DNAMarker；泳道 1：日本晴；泳道 2-24 分别为 D1、D3-1、D3-2、D4、D4-1、D4-2、D6、D11、D14、D19、D22、D22-2、D23、D24、D26、D30、D31、D32、D36、D38、D41、D42。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.41

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