棉铃虫转录组分析流程构建及Bt抗性差异表达基因分析

发布时间：2020-05-21 12:40

【摘要】：随着测序技术的快速发展,测序质量与通量不断提高,成本迅速下降,转录组学研究进入了黄金发展时期。为了更进一步地了解非模式生物,本文基于最新数据库与高被引工具构建了一套转录组分析流程,并利用此流程分析了实验室4个棉铃虫Helicoverpa armigera抗性品系与1种敏感品系的差异表达基因。研究的主要结果如下:1.5个品系的测序数据结果均得到2000万以上的reads,平均74亿bp的转录组数据,过滤后碱基质量均达到Q30以上。2.使用5种方法对Trinity拼接得到的234808条转录本进行质量检测,N50为928bp,Bowtie2回贴比对率均在98%以上,Ex90N50为2042bp,BUSCO检测到95%的昆虫保守基因。蛋白库Nr、Uniprot、Pfam比对的结果中Diamond优于Blast。Nr库比对结果有47%的转录本序列比对到棉铃虫,21%比对到烟草夜蛾,还比对到了家蚕、斜纹夜蛾、二化螟等鳞翅目昆虫。3.组内生物学重复Pearson相关系数接近0.9,组间聚类与PCA分析均各自聚在一起,无批次效应。4.使用DESeq2和edgeR软件分别对Salmon、RSEM得到的表达矩阵进行差异分析,结果edgeR与Salmon的组合得到差异表达基因数量最多。5.DU品系共得到1156个差异表达转录本,397个可以对应到RefSeq ID,GO分析有5个基因与氨肽酶活性有关,12个基因影响蛋白酶活性,2个基因相应抗菌免疫过程;KEGG分析有10个基因参与了肽酶通路。6.LFC2品系共得到995个差异表达转录本,268个可以对应到RefSeq ID,GO分析有4个基因与蛋白激酶抑制剂活性有关,6个基因影响跨膜转运蛋白活性,3个基因与蛋白酶体变化有关;KEGG分析有5个基因在蛋白酶激活受体信号通路发挥作用,3个基因参与了蛋白酶体通路。7.XXCAD品系共得到982个差异表达转录本,278个可以对应到RefSeq ID,GO分析有8个基因与前体代谢物的产生有关,3个基因与蛋白酶体有关,3个基因与糖基转移酶有关;KEGG分析有6个基因富集在细胞色素P450代谢通路和药物代谢通路。8.RS品系共得到1201个差异表达转录本,281个可以对应到RefSeq ID,GO分析有15个基因与ATP代谢过程相关,12个基因可以调节ATP的活性,有7个基因与前体代谢物的产生相关,2个基因参与胆固醇运输途径,3个基因参与脂肪转运途径,12个基因与核苷酸代谢途径相关;KEGG分析有2个基因富集到糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白通路,2个基因富集到蛋白酶体通路,9个基因富集到肽酶通路。
【图文】：

文件格式,测序

cDNA 文库构建及测序RNA样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。随后加入fragmer 将 mRNA 打断成短片段，，以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成一链 c加入缓冲液、dNTPs 和 DNA polymerase I 和 RNase H 合成二链 cDNA，ure XP beads 进行纯化。纯化的双链 cDNA 先进行末端修复、加 A 尾并连接再用 AMPure XP beads 进行片段大小选择。最后进行 PCR 扩增，并用 AMP 纯化 PCR 产物，得到最终的文库。利用 Illumina Hiseq 4000 或 Miseq 测序库，将初始的图像信息经过 Base calling 转为序列数据，即原始测序数据（raw 原始测序数据质量控制下机的测序数据以 Fastq 格式存储，Fastq 文件格式如图 1。

质量图,碱基,转录本,样本

图 2 全部样本碱基质量Fig. 2 Base quality scores in all samples2 拼接转录本质量检测2.1 N50 统计指标总共拼接得到 234808 条转录本，基于所有转录本的 N50 为 2243，表示至上序列拼接得到的长度为 2243bp。另外还有一个基于最长转录本亚型form）的 N50 为 928bp，这个值减少了因拼接得到太多转录本亚型而产生的更适合说明拼接完整性问题。一般 Longest isoform N50 在 1000bp 左右都是此结果表示拼接的完整性较好。2.2 回贴比对
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.622.3

【参考文献】