重庆主栽辣椒品种对番茄斑萎病毒的抗性及病毒变异分析

发布时间：2020-05-23 00:56

【摘要】：番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)的代表成员,是世界上危害最大的十种植物病毒之一。辣椒是我国重要的蔬菜经济作物,而重庆是我国辣椒的主产区和集中消费区之一,辣椒是重庆重点发展的农业支柱产业。2015年本实验室在重庆地区的辣椒上检出TSWV,目前该病毒已在重庆地区广泛发生。明确重庆地区辣椒品种对TSWV的抗病性,可为育种工作者提供科学依据,对于防止TSWV在重庆辣椒上的流行具有重要意义。本研究通过对重庆主栽辣椒品种进行人工摩擦接种TSWV,利用斑点酶联免疫吸附法(Dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)和反转录聚合酶链式反应法(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对主栽辣椒品种进行抗病性分析,结合实时荧光定量RT-PCR技术(Real-time quantitative RT-PCR,RT-qPCR)对不同主栽辣椒品种中TSWV的积累量进行了分析,结合症状观察及发病情况来确定重庆主栽辣椒品种的抗病性;最后对TSWV在不同抗病性辣椒上的遗传变异进行了分析。本研究以8种不同重庆主栽辣椒品种:渝辣10号、渝椒12号、渝椒五号、艳椒425、早春、艳椒11、艳椒417、农世缨朝天椒为试验材料,经人工接种TSWV,20天后进行Dot-ELISA检测和RT-PCR检测及抗病性调查,结果显示:Dot-ELISA的检测结果与RT-PCR的检测结果一致;艳椒417的发病率和病情指数分别为51.4%和61.11,在所检测的8个品种中发病最严重,是对TSWV最为敏感的品种;其次是艳椒425,发病率和病情指数为48.6%和45.56;渝辣10号、渝椒12号和朝天椒对TSWV的抗病性次之;而早春和渝椒5号对TSWV抗病性相对较强;艳椒11对TSWV的相对抗病性最强,发病率和病情指数分别为17.1%和25.00。为了进一步明确8种不同重庆主栽辣椒品种对TSWV的抗病性,本研究利用RT-qPCR技术分析不同品种辣椒中病毒的积累量,进一步比较各辣椒品种对TSWV的抗病性。结果显示,在8个不同的辣椒品种中,TSWV积累量最高的是艳椒417;其次是朝天椒和艳椒425;渝辣10号和渝椒12号的病毒积累量也较高;早春和渝椒5号的相对较低;而艳椒11中TSWV的积累量最低。结合症状观察及发病情况分析,进一步确认艳椒417对TSWV最敏感,艳椒11对TSWV表现相对较强的抗病性。在辣椒接种TSWV后15天(dpi)、30 dpi、60 dpi、85 dpi、100dpi、150 dpi分别检测不同辣椒品种中TSWV的积累量,结果发现,不同的品种在接种后均表现出TSWV积累量先增加后下降的趋势;其中,艳椒417、渝辣10号、艳椒425、早春和红缨朝天椒在60 dpi时达到TSWV积累的最高峰;而艳椒11、渝椒12号和渝椒5号在85 dpi时达到TSWV积累的最高峰。艳椒417和艳椒11均为重庆辣椒品种,但抗病性差异很大,为了明确TSWV在这两个辣椒品种中的变异水平,本研究以不同抗病性的辣椒品种艳椒417和艳椒11为材料,分别接种TSWV,扩增了接种植株中TSWV的非结构蛋白(nonstructure protein,NSs)基因,构建了艳椒417早期(50 dpi)、后期(150 dpi),艳椒11早期(50 dpi)、后期(150 dpi)4个种群,并对这4个种群的遗传结构及变异进行了分析。分析结果发现,TSWV NSs基因组种群在不同抗病性的辣椒上的遗传多样性不同,TSWV NSs基因组种群在艳椒417上的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为:0.284±0.102、0.00068±0.00042;在艳椒11上的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为:0.649±0.086、0.00088±0.00022。且TSWV NSs基因在这两种辣椒上未检测到重组现象。这4个种群的遗传结构符合病毒“准种”特征,艳椒11早期、艳椒11后期、艳椒417早期、艳椒417后期种群的突变克隆百分率分别为42.10%、38.89%、6.67%、16.67%;各突变频率分别为5.30×10~(-4)、4.43×10~(-4)、1.32×10~(-4)、1.48×10~(-4),可以看出TSWV NSs基因组种群在艳椒11上的遗传变异水平高于艳椒417。对4个种群的主序列两两对比发现,艳椒11早期和晚期的主序列同源率为100%,艳椒417的早期和晚期的主序列同源率也为100%,但是将艳椒11主序列、艳椒417主序列及接种本氏烟上的NSs基因序列比对,发现在1500 bp的序列上的766核苷酸位点艳椒11上TSWV NSs基因发生了A→G的突变类型,而艳椒417及接种本氏烟上的TSWV NSs基因没有发生突变,而这一位点的突变导致谷氨酸变为了甘氨酸。综上所述,本研究明确了8种重庆主栽辣椒品种对TSWV的抗病情况,其中艳椒417对TSWV的侵染最敏感,而艳椒11表现出最强的相对抗病性;对TSWV在艳椒417和艳椒11中遗传变异情况的分析表明,TSWV在艳椒11上的遗传变异更为丰富。本研究对抗TSWV辣椒品种的选育以及TSWV引致病害的有效防控具有一定的参考价值。
【图文】：

质量检测,检出率

利用 TSWV 的特异性血清进行 Dot-ELISA 检测。结果表明，在所检测的 8 个品种中，艳椒 417 是对 TSWV 最为敏感的品种，检出率最高为 51.4%；其次是艳椒 425，检出率为 48.6%；朝天椒、渝椒 12 号和渝辣 10 号对 TSWV 也较为敏感，检出率分别为 37.1%、34.2%和 28.6%；渝椒五号和早春的检出率相对较低，分别为 22.9%、20%；艳椒 11 的检出率最低，仅为 17.1%（表 2-2）。表 2-2 不同品种辣椒接种 TSWV 后 ELISA 检测结果Tab.2-2 The Detection of TSWV by ELISA in infected peper辣椒品种渝椒 12 号渝辣 10 号渝椒五号艳椒 417 艳椒 11 艳椒 425 早春接种总株数 35 35 35 35 35 35 35 发病株数 12 10 8 18 6 17 7 检出率（%） 34.2 28.6 22.9 51.4 17.1 48.6 20 3.1.2 接种 TSWV 的不同品种辣椒 RT-PCR 检测结果采取 7 dpi 和 20 dpi 时不同主栽辣椒品种（每个品种 7 份样品，5 次生物学重复）的叶片，用 Trizol 法提取辣椒叶片总 RNA，电泳后可以看到清晰的三条带：28S、18S、5S（图 2-1），说明提取总 RNA 的质量比较好，可用于后续的实验。

朝天椒,检出率,方法,辣椒

第二章重庆主栽辣椒对 TSWV 的抗性评价以辣椒总RNA为模板，反转录后，用扩增TSWV的特异性引物TSWV CP-F/R：GAAGCAATAAGAGGTAAG/TGCTTTGTTGACACAAGGCA，，对接种的不同品椒样品进行 RT-PCR 反应（每个品种 35 份样品）。琼脂糖凝胶电泳结果显示， 417 检出率为 51.4%；艳椒 425 为 48.6%；朝天椒检出率为 37.1%；渝椒 12出率为 34.2%；渝辣 10 号检出率 28.6%；渝椒 5 号和早春的检出率相对较低，为 22.9%、20%；艳椒 11 的检出率最低，仅为 17.1%（图 2-2）。和 ELISA 检果一致。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.418

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