条锈菌效应蛋白Pst-1374与小麦靶标蛋白TaTrxm的互作模式研究

发布时间：2020-05-23 21:58

【摘要】：由条形柄锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Eriks,Pst)引起的小麦条锈病,其病原菌是专一性的气传性真菌,有易传染、易突变等特点。不断有新的条锈菌小种出现,是造成小麦条锈病的大规模爆发,引起小麦产量的严重下降的重要原因。条锈菌侵染小麦是通过专一性的侵染器官——吸器完成的,它由吸器的细胞壁、细胞膜、寄主细胞的细胞膜形成颈型,使其成为一个封闭的、寄主细胞非原生的结构。吸器通过向寄主细胞分泌效应蛋白,改变寄主的防御反应,从而向寄主吸收营养物质和能量,完成小麦的侵染过程。效应蛋白是病原菌产生的,能够改变宿主细胞结构和功能的小分子蛋白,它可以与寄主细胞的大分子发生相互作用,改变寄主细胞的防御反应,达到侵染的目的。小麦条锈菌效应蛋白Pst-1374来源于条锈菌美国小种PST-78夏孢子的cDNA文库,含有109个氨基酸,其中有6个半胱氨酸。在前期研究中,发现Pst-1374在本氏烟上的瞬时表达能够抑制BAX蛋白诱导的细胞坏死;Pst-1374也能抑制寄主的效应子触发免疫(Effector-Triggered Immunity,ETI)反应,表现在活性氧和坏死面积的减少。从条锈菌与小麦互作的非亲和的cDNA文库中用酵母双杂筛选、进一步用Pull down进行鉴定,发现Pst-1374与小麦叶绿体硫氧还蛋白TaTrxm能发生互作,也可以和自身互作。能和自身互作的结果,提示其可能是以多聚体的形式存在;其次Pst-1374富含半胱氨酸并且能和硫氧还蛋白互作,而硫氧还蛋白能解开二硫键。因此我们提出猜测:Pst-1374可能通过二硫键形成多聚体,TaTrxm通过打开二硫键使Pst-1374解聚成单体从而行使其功能。本研究利用原核表达体外纯化效应蛋白Pst-1374与靶标蛋白TaTrxm,使用生物化学与结构生物学的方法,如:凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography,GFC)、硫氧还蛋白活力测定、圆二色谱(Circular Dichroism,CD)、动态光散射(Dnamic Light Scattering,DLS)等技术测定Pst-1374与靶标蛋白TaTrxm的互作模式,实验结果如下:1.成功构建了Pst-1374和TaTrxm的原核表达载体;通过Ni柱和高效液相色谱对Pst-1374进行纯化;通过直链淀粉柱对TaTrxm进行纯化,得到电泳纯的蛋白。2.结构预测发现Pst-1374整体结构松散,只有小部分α-螺旋结构,大部分为无规则卷曲;通过圆二色谱实验发现Pst-1374的α-螺旋结构能被三氟乙醇(Trifluoroethanol,TFE)诱导产生,NaCl浓度能改变Pst-1374的二级结构组成;动态光散射实验发现Pst-1374在溶液中存在两种粒径分子。凝胶过滤层析实验证明Pst-1374是多聚体,二硫键参与多聚体的形成。3.TaTrxm的牛胰岛素实验证明了其具有硫氧还蛋白的活性;TaTrxm与Pst-1374反应实验证明了TaTrxm能通过打开二硫键解聚Pst-1374,证明Pst-1374通过与TaTrxm互作使多聚体打开行。通过上述实验结果,我们可以证明Pst-1374在溶液中通过二硫键形成多聚体,以多聚物的形式存在。TaTrxm与Pst-1374作用可以打开Pst-1374的二硫键,使多聚物发生解聚。这些实验的结果能够证明我们提出的“Pst-1374可能通过二硫键形成多聚体,TaTrxm通过打开二硫键使Pst-1374解聚成单体”的猜测,为后续研究Pst-1374如何改变宿主小麦防御机制提供思路。
【图文】：

示意图,小麦锈病,发育阶段,示意图

图 1-1 小麦锈病发育阶段的示意图Figure 1-1 Aschematic diagram of the development stage of wheat rust1.2 效应蛋白的致病机理1 2 1 效应蛋白的定义效应蛋白通常出现在植物和病原菌之间相互作用领域，通常将其定义为“病原产生的，改变寄主细胞防御机制的小分子”(Stergiopouloset al.,2009)。效应蛋白的现，解决了植物和真菌互作中“无毒因子”和“激发子”不能共存的现状(Stergiopoulet al., 2009)。效应蛋白通常通过其自身的功能或者其在寄主细胞的活动来命名，其名通常揭示了其自身的特点及其功能。在植物和病原菌的互作进化中，效应蛋白通常要面对来自寄主细胞的恶劣生存境，这使得它不得不进化出更加稳定的结构来面对这些困难，二硫键的增加是一种效的办法，半胱氨酸形成的二硫键有更加牢固的分子键，能够更好的稳定效应蛋白三维结构，发挥其功能(Martin et al., 2008； Sébastien et al., 2011)；许多的效

实验设计

分子在一定时间的移动与其分子大小有关，粒径大的分子比粒径小的分子此，为保证分子运动状态相同，通常采用不同强度的散射光。动态光散射光时遇到分子，，入射光散射强度与分子大小有相关性(Stetefeld et al., 201实验思路和设计麦条锈菌通过其吸器向寄主细胞分泌效应蛋白达到其增殖的目的。通过前小种 PST-78 的分泌组进行测序、筛选，我们找到效应蛋白 Pst-1374 在病原中发挥着重要作用。前期实验结果发现 Pst-1374 在本氏烟上的瞬时表达能蛋白诱导的细胞坏死；利用农杆菌在烟草上瞬时表达发现 Pst-1374 定位于发现 Pst-1374 能抑制寄主的 ETI 反应；从条锈菌与小麦互作的非亲和的 cD筛选和酵母双杂鉴定，发现 Pst-1374 可以和小麦叶绿体硫氧还蛋白 TaTrx生互作。Pst-1374 在侵染过程中发挥着如此重要作用，那它与其靶标 TaTrx作的？我们通过结构生物学和生物化学两方面的技术对 Pst-1374 在发挥功进行研究，下图是本实验的设计图：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.121.42

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