BmCKI的鉴定及其调控家蚕丝腺细胞核内周期的研究

发布时间：2020-05-28 12:36

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)是重要的泌丝经济昆虫。丝腺是家蚕幼虫特有的泌丝器官,丝蛋白大量合成的前提是丝腺细胞进行核内周期(endocycle)。核内周期,也称为核内复制周期,是正常有丝分裂细胞周期的变异形式,即细胞只进行DNA复制而不发生胞质分裂,从而形成了多倍体细胞。家蚕丝腺细胞仅在胚胎期发生约10次有丝分裂,形成了包含前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺约1080个细胞。自此之后,丝腺细胞进入核内周期,只进行DNA的合成和细胞体积的增大。在幼虫期,丝腺细胞经历持续的17~19轮核内周期,使得DNA含量达到正常二倍体细胞的约40万倍,这为吐丝期丝蛋白的大规模合成奠定了遗传基础。果蝇和小鼠中核内周期的研究表明,核内周期的运转是由细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的周期性振荡驱动的。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)是CDK的主要负调节因子,它能与细胞周期蛋白(cyclin)和CDK结合并抑制CDK的激酶活性。与自然界其它进行核内周期的细胞相比,家蚕丝腺细胞发生核内复制的时间跨度更长,DNA复制效率更高效,是研究核内周期的理想材料,阐明丝腺细胞核内周期的调控机制,可为完善家蚕细胞周期调控机制提供重要线索,也可为丝腺遗传改良提供重要的理论依据。本研究对家蚕CKI进行了克隆和鉴定,并分析了该基因参与调控丝腺核内周期的作用机制,为家蚕丝腺细胞核内周期机制的解析和家蚕丝腺遗传改良提供了有利依据。主要研究结果和结论如下:1.BmCKI基因的鉴定及特征分析家蚕基因组中仅存在一个Cip/Kip家族同源基因,将该基因命名为BmCKI。BmCKI有两个剪切体,分别命名为BmCKI-L和BmCKI-S。这两个剪切体具有不同的5’非编码区(5’untranslated region,5’UTR),BmCKI-S从第二个外显子处的起始密码子进行翻译。BmCKI-L的编码区(coding sequence,CDS)全长654 bp,编码217个氨基酸(amino acid,aa),而BmCKI-S的CDS长度为579 bp,编码192个氨基酸,两者的CDS仅在5’端相差75 bp。序列分析显示,BmCKI-L和BmCKI-S存在Cip/Kip家族保守的结构域,该结构域包含cyclin结合位点和CDK结合位点。系统发生树分析显示,家蚕BmCKI蛋白与果蝇的同源蛋白聚在一支,两者同源性最高。免疫荧光分析BmCKI-L和BmCKI-S的亚细胞定位,结果显示两者均定位于细胞核。为了鉴定BmCKI的核定位信号,我们构建了一系列BmCKI-L的截短突变,并通过免疫荧光分析其定位情况。结果表明,181-210 aa区域是BmCKI-L核定位序列所在之处,该区域存在一个非典型的二元核定位信号,该核定位信号前后由两簇基本氨基酸组成,中间由16 aa连接,连接区域富含弱碱性的组氨酸。用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析了BmCKI-L和BmCKI-S的组织表达模式,发现BmCKI-L在表皮和卵巢的表达量较高,而在精巢的表达量较低;BmCKI-S在中肠的表达量比较高,而在丝腺的表达量最低,表明BmCKI-L和BmCKI-S存在不同的表达模式。2.BmCKI对家蚕细胞周期的调控为了在细胞水平上鉴定BmCKI的功能,我们首先在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G1期细胞显著增加,S期和G2期细胞显著减少,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S导致细胞周期阻滞在G1期;在过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞中BrdU标记率明显下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制DNA复制;过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显著下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制细胞增殖。同时,在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G2/M期细胞显著增加,S期和G1期细胞显著减少,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S使细胞积累于G2/M期;在干涉BmCKI-L和BmCKI-S的细胞中BrdU标记率显著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进DNA复制;干涉BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进细胞增殖。综上表明,BmCKI-L和BmCKI-S参与细胞周期调控。为了探究BmCKI调控细胞周期的机制,我们利用qRT-PCR分别检测了过表达和干涉BmCKI后各周期调控因子的相对表达量。结果显示,过表达BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E以及周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK4表达量显著下调,说明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制G1和S期各周期调控因子的表达;干涉BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A和cyclin B以及周期蛋白依赖性激酶CDK1表达量显著上调,说明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进G2和M期周期调控因子的表达。3.BmCKI对家蚕个体生长发育的调控为了在个体水平上鉴定BmCKI的功能,我们利用家蚕转基因技术,创制了全蚕过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为BmCKI-L-OE。对BmCKI-L-OE品系G1代的蚕卵进行观察,发现约2/3的胚胎致死,1/3的胚胎能成功孵化。相较于同龄期正常大造,BmCKI-L-OE幼虫体型小且存在不同程度的发育迟缓,此外在饲养过程中BmCKI-L-OE幼虫逐渐死亡。我们对BmCKI-L-OE品系在胚胎期和幼虫期的存活率进行统计分析,结果显示在家蚕中过表达BmCKI-L会引起胚胎及幼虫致死。解剖BmCKI-L-OE品系5龄幼虫,发现BmCKI-L-OE品系幼虫多个组织的发育存在异常,比如:马氏管萎缩;气管分支显著减少且长度严重缩短;丝腺显著变小;脂肪体很少。以上结果表明,BmCKI参与家蚕生长发育的调控。4.BmCKI对家蚕丝腺核内周期的调控为了鉴定BmCKI是否参与丝腺细胞核内周期调控,我们利用家蚕转基因技术,创制了丝腺组织特异性过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为Ser1~P-BmCKI-L-OE。表型分析结果显示Ser1~P-BmCKI-L-OE幼虫相比于正常大造体型明显要小,体重明显要轻;以及其丝腺的大小、长度、直径和重量都要明显小于大造幼虫的,表明在家蚕丝腺组织中过表达BmCKI-L会抑制丝腺的生长发育。经济性状分析结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的全茧量、蛹重、茧层量相比于正常大造都显著减轻;同时,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的茧层率相比于正常大造显著减小。利用冷冻切片和DAPI染色检测丝腺细胞DNA含量的变化,结果发现,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺的DAPI标记量均显著低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系DNA含量比大造组少;对Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的丝腺体外进行BrdU标记以测定丝腺DNA复制情况,结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺BrdU标记率均低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系丝腺DNA复制相较于大造品系减弱。以上结果表明,在丝腺组织中特异性过表达BmCKI-L抑制丝腺细胞的核内周期。5.BmCKI相互作用蛋白的鉴定及作用机制研究为了鉴定BmCKI的作用机制,我们首先通过酵母双杂交技术,以BmCKI-L蛋白为诱饵筛选到3个与BmCKI-L可能存在相互作用的蛋白,分别是BmPCNA、BmRACK1和BmSTMN。通过酵母双杂交回转实验,免疫荧光共定位以及免疫共沉淀技术证实这3个蛋白与BmCKI-L都具有相互作用。PCNA是DNA聚合酶的辅助因子,在DNA复制和修复中起到重要作用。RACK1是一个具有7个色氨酸-天冬氨酸重复序列的支架蛋白,在细胞不同区域分别结合各种蛋白,从而在许多基本生理过程中都发挥重要的作用。STMN是一种微管不稳定蛋白,存在于胞质中,与微管解聚有关。qRT-PCR分析这3个基因的组织表达谱,结果显示BmPCNA基因在丝腺中特异性高表达,BmSTMN基因在丝腺特异性中低表达,而BmRACK1基因在各个组织中均有较高的表达。流式检测BmPCNA过表达和干涉对细胞周期的影响,结果显示过表达BmPCNA后,S期细胞增加,而干涉BmPCNA后,S期细胞减少。推测,过表达BmPCNA抑制DNA的复制从而导致S期细胞减少;反之,干涉BmPCNA促进DNA的复制从而引起S期细胞增加。qRT-PCR结果表明,BmCKI-L处于BmPCNA的上游,并抑制BmPCNA的表达。推测,BmCKI-L可能通过抑制BmPCNA,调控DNA复制,从而调控细胞周期。流式结果显示过表达BmRACK1,G1期细胞增加,G2/M期细胞减少;而干涉BmRACK1,G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。qRT-PCR结果表明,BmRACK1可能处于BmCKI-L的上游,并促进BmCKI-L的表达。推测,过表达BmRACK1,引起BmCKI-L表达量上升,从而导致G1期细胞增多,G2/M期细胞减少;反之干涉BmRACK1,降低了BmCKI-L的表达量,使得G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。流式结果显示,无论过表达还是干涉BmSTMN都会引起G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。推测,持续过表达或干涉BmSTMN,都会导致纺锤体无法顺利组装,从而将细胞周期阻滞在M期。qRT-PCR结果显示,BmCKI-L处于BmSTMN的上游,并抑制BmSTMN的表达。推测,BmCKI-L可通过抑制BmSTMN,调控细胞骨架网络,从而调控细胞周期。综上,我们构建了可能的BmCKI调控细胞周期网络。BmCKI可通过多种途径参与正常有丝分裂周期和丝腺核内周期的调控:BmCKI与cyclin-CDK复合物结合并抑制复合物的活性,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmPCNA,调控DNA复制,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmSTMN,调控细胞骨架动力学,参与细胞周期调控;此外,BmRACK1影响BmCKI的表达。
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细胞周期,细胞分裂期

第一章文献综述周期胞周期概述次细胞分裂期结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞称为一个细胞周期。一个标准的细胞周期可以人为地划分为先：G1 期、DNA 合成期（S 期）、G2 期和细胞分裂期（M 期）（ DNA 复制的准备期，主要特点是细胞中大量合成 DNA 复制所需类和脂质等。S 期是细胞周期进程中最重要的一个时期，细胞中复制，同时也合成组蛋白及非组蛋白。G2 期是细胞分裂的准备量合成 RNA、ATP 及一些与 M 期结构、功能相关的蛋白质，形成的基本单位微管蛋白。M 期细胞进行分裂，此期内细胞形变化，染色体凝集及分离，核膜、核仁破裂及重建，纺锤体、，继而细胞核发生分裂形成两个子核后，胞质一分为二，细胞完成

哺乳动物细胞,因子,复合物,核纤层蛋白

西南大学博士学位论文无法向 G1 期逆转[24]。cyclin A-CDK 复合物是 S 期最主要的 cyclin-CDK 复合物，能启动 DNA 的复制，并阻止已复制的 DNA 发生重复复制[25]。G2 期晚期形成的cyclin B-CDK 复合物在促进 G2 期向 M 期转换的过程中起到关键作用，cyclinB-CDK1 复合物磷酸化组蛋白 H1、核纤层蛋白等多种蛋白，促进染色质凝集，核纤解聚等，从而促使细胞进入 M 期。M 期细胞在形态结构上所发生的变化以及中期向后期、M 期向下一个 G1 期的转化均与 cyclin B-CDK1 复合物有关。在有丝分裂后期末，，cyclin B 在激活的 APC 作用下，经多聚泛素化途径被降解，cyclinB-CDK1 复合物解聚、失活，促使细胞转向末期，此时细胞中因失去 cyclin B-CDK1的活性，磷酸化的组蛋白、核纤层蛋白等可在磷酸酶作用下发生去磷酸化，染色体又重新开始凝集、核膜也再次组装，子代细胞核逐渐形成。后期末 cyclin B-CDK1的活性降低，也促进了胞质分裂的发生。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S881.2;Q78

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