利用RNAi技术沉默稻纵卷叶螟CmTre和CmCHS基因

发布时间：2020-06-02 21:45

【摘要】：水稻Oryza sativa是全世界人民重要的谷类粮食作物之一,水稻丰产丰收和人民的生活息息相关。稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis,又名苞叶虫等,属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae,是稻米中最具有破坏力的害虫之一。几丁质(chitin)又名甲壳素,是重要器官的主要成分,例如昆虫表皮和中肠,并且是昆虫生长和发育所必需的。昆虫海藻糖酶(Tre)和甲壳素合成酶(CHS)分别是昆虫合成甲壳素过程中的第一种和最后一种酶,它们在昆虫甲壳素的合成中起重要作用,并且是治理害虫的理想目标。随着RNA干扰技术的阐明,近年来,该技术已经被广泛应用于昆虫基因功能和害虫防治的研究。本研究以稻纵卷叶螟C.medinalis为研究对象,以海藻糖酶和甲壳素合成酶基因为靶标,体外合成双链RNA(dsRNA),通过注射RNAi技术检测dsRNA对稻纵卷叶螟靶标基因的抑制效率,再利用转基因RNAi技术,在水稻中表达海藻糖酶和甲壳素合成酶基因的dsRNA,稻纵卷叶螟在取食这种转基因水稻后引起RNAi效应,导致其生长发育受阻,蜕皮困难导致死亡,从而实现稻纵卷叶螟的绿色防控。1.注射dsRNA沉默CmTre和CmCHS的表达根据本实验室克隆的稻纵卷叶螟海藻糖酶基因(CmTre)和几丁质合成酶基因(CmCHS)的开放阅读框(ORF)设计靶标位点,并在体外合成各自的dsRNA(dsCmTre,dsCmCHS),用水稻叶片的第三龄幼虫注射dsRNA,观察试虫表型变化和幼虫生长情况,计算各组死亡率,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测试虫体内CmTre和CmCHS的表达量。结果显示,注射dsCmTre和dsCmCHS处理组幼虫取食量减少,活性降低,体型变小,体重减轻,并出现典型的致死表型,部分出现死亡情况,而注射dsGFP对照组虫体表型无明显变化,生长发育情况良好。RT-qPCR检测结果显示,在注射dsRNA 5 d后,相比于注射dsGFP的对照组,dsCmTre和dsCmCHS处理组CmTre1的表达下降了48.54%、CmTre2的表达下降了51.03%、CmCHSA的表达下降了59.07%、CmCHSB的表达下降了58.80%。以上结果表明,注射dsCmTre和dsCmCHS后稻纵卷叶螟幼虫生长发育受阻,蜕皮困难,CmTre和CmCHS的表达量显著被抑制,具有明显致死效应。2.RNAi表达载体的构建与鉴定以注射RNAi验证的靶标序列为目的片段,将其正向序列和反向互补序列各自插入到水稻磷脂酶D基因(PLD)部分内含子的两侧,经公司合成并克隆到载体PUC57后,再经过酶切连接到表达载体pCAMBIA1301上,构建重组植物RNAi p1301-Tre-CHS的表达载体,通过PCR,酶切和双重测序后将重组RNAi表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中,成功制备了基因工程菌。3.转基因植物的遗传转化及RNAi检测用含RNAi表达载体的农杆菌侵染蜀恢527水稻愈伤组织,经过共培养,抗性筛选,分化,生根,获得10株转基因水稻。用转基因水稻饲喂稻纵卷叶螟幼虫,观察其表型变化,死亡率变化,以及RT-qPCR检测转基因水稻能否介导昆虫体内RNAi效应。结果显示,试虫在摄取转基因水稻后,体型小与对照组,且出现明显的致死表型,部分不能正常化蛹,或能生长至蛹,但蛹畸形或小于正常蛹。取食转基因水稻5 d后,实验组试虫死亡率为46.67%,校正死亡率为45.45%,相比于对照组,死亡率增加了44.45%。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,用转基因食物喂养的测试昆虫中的CmTre1表达降低48.06%、CmTre2的表达下降了49.84%、CmCHSA的表达下降了54.22%、CmCHSB的表达下降了54.63%。以上结果表明,表达CmTre和CmCHS dsRNA的水稻能有效介导昆虫体内RNAi效应,对稻纵卷叶螟具有很好的防治效果。
【图文】：

图 2.1 dsRNA 合成电泳图Fig. 2.1 Electrophoresis of dsRNAsynthesisA：CmTre、CmCHS 和 GFP 靶标序列扩增片段电泳图；B：dsCmTre、dsCmCHS 和 dsGFP电泳图。Note: A: Electrophoretogram of PCR amplication of CmTre, CmCHS and GFP; B:Electrophoretogram of dsCmTre, dsCmCHS and dsGFP. M: DL2000 DNAmarker.A B

贵州大学 2019 届硕士论文图 2.2 卷叶虫可溶性海藻糖酶基因（A）、膜结合型海藻糖酶基因（B）、几丁质合成酶 A基因（C）和几丁质合成酶 B 基因（D）RT-qPCR 扩增产物的引物溶解曲线图Fig 2.2 The dissociation curve of amplification product of CmTre1(A), CmTre2(B), CmCHSA(C)and CmCHSB(D) gene in RT-qPCR of C. medinalis
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.112.1

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本文编号：2693816