基于RNAi技术靶向二点螟CiChi1基因创制转基因甘蔗抗虫种质的研究

发布时间：2020-06-06 23:56

【摘要】：二点螟Chilo infuscatellus(Snellen)属于鳞翅目螟蛾科,是为害甘蔗的主要害虫之一,在我国各主要蔗区为害普遍。选育抗性品种是最直接、经济有效的防御害虫的方法,但是,由于甘蔗抗虫种质的缺乏,通过常规杂交手段难以培育出高效的抗螟虫甘蔗品种。本文在对不同生育期的二点螟进行转录组测序和分析的基础上,对二点螟几丁质酶相关基因进行全长克隆、表达和功能分析,筛选出对二点螟生长发育具有显著致死效果的靶标基因及其dsRNA序列,利用基因枪介导的遗传转化体系将含有二点螟CiChi1基因dsRNA序列的RNAi植物表达载体导入甘蔗心叶组织,创制抗二点螟的甘蔗转基因植株,拟为甘蔗螟害综合治理开辟一条新的途径。本研究取得以下几个方面研究结果:(1)选取不同发育阶段的二点螟进行转录组测序,共获得4424800002个核苷酸,被组装成95921个unigene基因,平均组装长度为1542 bp,N50和N90分别为2591 bp和653 bp。对这些unigenes基因在不同数据库中进行注释,共有53815条unigenes可以被注释到不同数据中,占56.1%,其中有47849、36605和19406条unigenes成功注释于Nr数据库、Pfam数据库和Nt数据库,分别占注释unigenes总数的88.9%、68.0%和36.1%,此外,有36890条unigenes被成功注释在55个GO条目中,占68.5%。(2)从二点螟转录组数据中筛选出二点螟几丁质酶相关基因,并成功克隆了三个二点螟几丁质酶基因(CiChi1、CiChi2和CiChi11)和一个几丁质酶结构域1(CiChid1)片段。对这些基因进行荧光定量PCR检测,发现具有不同时空表达模式。CiChi1在成虫最高表达,而在6龄前都显著低表达;CiChi2则在6龄和成虫高表达,5龄的表达量最低;CiChi11的表达量则是在成虫期时低表达,3龄最高表达;CiChid1在5龄高表达,1-3龄低表达。而在不同组织部位中,CiChi11和CiChid1,是在中肠组织高表达,而在头部和表皮组织中低表达;CiChi1和CiChi2则是在表皮组织中高表达,而在头部和中肠组织中表达量相对较低。(3)利用RNAi技术对二点螟CiChi1基因进行功能分析,结果显示注射二点螟CiChi1基因的dsRNA,影响了二点螟的生长发育。与对照相比,注射7天后,存活的二点螟体内CiChi1基因表达量下降了70-80%,幼虫的死亡率达62%。(4)将CiChi1片段的干扰序列发夹结构构建到植物表达载体pUC18中,获得pUC18-CiChi1载体,随后,连同pTEM73载体(内含抗草铵膦除草剂的Bar基因)质粒利用基因枪轰击法导入甘蔗心叶组织。以含有EGFP序列的载体为阴性对照。经过18%草铵膦的喷施筛选和PCR转基因检测,共鉴定出79株转CiChi1基因和5株转EGFP基因的甘蔗植株。定量PCR检测结果表明,转CiChi1基因植株均能表达干扰片段,但是不同转基因植株的表达量有所差异。
【图文】：

特异性地下调靶基因转录本的丰度。RNAi 效应的基本过程主要分为以下三步：首先，涉及到 dsRNA 被体内 RNaseⅢ家族 Dicer 酶降解成为 21-23个碱基的小干扰 RNA（siRNA）；然后，siRNA 在细胞内 RNA 解旋酶的作用下解链成正义链和反义链。继而，由反义 siRNA 再与体内 些如解旋、内切等酶结合形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex，RISC)；最后， RISC 与外源基因表达的 mRNA 的同源区进行特异性结合。因 RISC 表现出核酸酶的功能，在结合部位切割 mRNA，切割位点即是与 siRNA 中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂 mRNA 随即降解，导致翻译受阻，最终产生基因沉默现象[9, 10]。其中，Argonaute 蛋白是催化 RISC 的主要组成，利用 siRNA 作为模板进行识别和降解互补的 mRNA，RNA 干扰特异性的消耗目的基因的转录本，达到抑制或沉默基因的表达。RNAi 具有功能性的元件可分为两块， 是在细胞内的核心部件，包括 Dicer 酶，RNA 结合因子和 Argonaute 蛋白；另 部分是系统性的成分，其能够增加 dsRNA 的信号传导，，并且使其能够快速传递到其他的组织中[6, 7]。RNAi 作用流程如图 1-1 所示。

和电泳仪 美国 Bio-Rad中国 上海凌仪酶标仪 美国 BioTek实时荧光定量 PCR 系统 美国 ThermoA 文库构建和测序构建和 Illumina 测序均由北京诺禾致源科技股份EBNext Ultra RNA 文库制备试剂盒 (Illona ) 构建，RNA使用总量为1.5 μg。最终产物经过纯化步评估文库质量在 Agilent Bioanalyzer 2100 系统用 TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia) 上聚类索引编码的样本。生成后的集群，再将检验iseq 测序平台上进行测序，并产生相应的配对末图 2-1。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.661

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本文编号：2700478