蜂王浆糖蛋白糖链结构的表征及免疫活性研究

发布时间：2020-06-12 05:49

【摘要】：蜂王浆是由工蜂下咽和下领腺体分泌产生的一种浓稠的乳白色液体。具有许多药理学活性,如抗菌、抗肿瘤、抗过敏、抗炎和免疫调节等作用。蜂王浆中发挥免疫调节作用的主要成分是蛋白质,特别是蜂王浆主蛋白3(MRJP3)和蜂王浆主蛋白1(MRJP1)。近些年研究发现糖链可能参与免疫反应,故蜂王浆N-糖链的表征对其免疫调节的研究具有重要意义。本文以蜂王浆糖蛋白为研究对象,研究蜂王浆N-糖链的类型和结构,并对糖链与免疫活性的关系进行研究,为蜂王浆免疫反应的研究提供一定的参考。主要研究结果如下:本文采用超速离心法对蜂王浆进行超速分离,得到上层溶液、中层溶液和下层沉淀,将不同组分蜂王浆冻干得到上、中和下层蜂王浆冻干粉。对上、中和下层冻干粉进行基本成分分析,发现下层沉淀中蛋白含量为57.44%,总糖含量为12.8%,10-HDA的含量为8.9%。经SDS-PAGE分析发现下层蜂王浆的主要蛋白是MRJP1,分子量约为55kDa。并对上层溶液、中层和下层中的四条蛋白条带进行LC-MS鉴定,得上层溶液中的49kDa蛋白为蜂王浆主蛋白2(MRJP2)、60-70 kDa的蛋白条带为MRJP3,下层蜂王浆中的55 kDa蛋白为MRJP1。蜂王浆主蛋白中N-糖链的类型及结构研究。利阳肽-F糖苷酶(PNGaseF)将蜂王浆主蛋白1(MRJP1)的N-糖链释放出来,并对糖链进行甲基化处理,采用ESI-MS对糖链进行结构分析,结果表明:下层蜂王浆中检测到12条N-糖链,即6条高甘露糖型、4条杂合型和2条复合型糖链,其中一些糖链含有同分异构体。蜂王浆主蛋白N-糖链对抗原免疫活性的影响研究。通过ProtScale和IEDB在线软件对MRJP1的亲水性、可塑性、β转角和抗原线性表位进行预测。发现MRJP1的N-糖基化位点A28位于抗原表位区域,去糖基化蛋白可能对抗原抗体的结合产生影响。PNGaseF酶切除蜂王浆主蛋白中的N-糖链,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)来研究去糖基化对MRJP1免疫原性的影响,证实去糖基化蛋白(D-MRJP1)有效地降低了 MRJP1的IgG结合能力。并以MRJP1和去糖基化蛋白(D-MRJP1)为过敏原建立Balb/c小鼠免疫模型,对小鼠血清中MRJP1特异性IgE水平进行分析,发现去糖基化蛋白(D-MRJP1)免疫小鼠血清中特异性IgE水平显著降低,证明MRJP1的N-糖链参与免疫反应。
【图文】：

而Ｂ、Ｃ、Ｙ和Ｚ是由糖苷键断裂产生。下标数字表示裂解的位置，逡逑Ｘ、Ｙ和Ｚ离子的命名从还原端开始，而Ａ、Ｂ和Ｃ离子从非还原端开始命名，逡逑如图１－２所示。逡逑户邋＞邋ｙ＇邋Ｚ１邋：＞广广逡逑ＪＨｇ0Ｈ邋ｃ逦「＾邋ＣＨ２ＯＨ邋：逡逑图１－２糖链碎片Ｄｏｍｏｎ－Ｃｏｓｔｅｌｌｏ命名法逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋Ｄｏｍｏｎ－Ｃｏｓｔｅｌｌｏ邋ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ邋ｆｏｒ邋ｇｌｙｃａｎ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ逡逑８逡逑

逦４４．３邋—逦、岤２逡逑■悘－，，眺逡逑图２－１蜂王浆水溶液超速离心分离效果图邋图２－２蜂王浆超速分离后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｌｉｇａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ逦Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ逡逑ｏｆ邋ａｑｕｅｏｕｓ邋ｒｏｙａｌ邋ｊｅｌｌｙ逦ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｏｙａｌ邋ｊｅｌｌｙ逡逑注：图２－１中ＵＭＲＪＰｓ表示超速离心后的上层蜂王浆主蛋白、ＭＭＲＪＰｓ表示超速离心后的逡逑中层蜂王浆主蛋白、ＬＭＲＪＰｓ表示超速离心后的下层蜂王浆主蛋白；逡逑图２－２中１：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋２：超速离心上层蜂王團蛋白、３：超速离心中层蜂王装蛋白、４：超速逡逑离心下层蜂王浆蛋白、５：超速离心下层蜂王浆蛋白。逡逑２．３．２蜂王浆蛋白含量的结果分析逡逑ＢＣＡ法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ，二奎啉甲酸法）的测定方法是在碱性条件下，逡逑蛋白将Ｃｕ２＋还原为Ｃｕ＋，Ｃｕ＋与ＢＣＡ试剂形成络合物并在５６２邋ｎｍ处的吸收值最逡逑大，吸光值与蛋白质浓度成正比，故可根据吸收值测定蛋白浓度。该方法灵敏度逡逑高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定，不宜被干扰。逡逑以蛋白浓度为横坐标，５６２邋ｎｍ处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线如图２－３逡逑所示，标准曲线方程为ｙ＝０．００９３ｘ＋０．０３７２，邋Ｒ２＝０．９９６９，将蛋白样品的吸光值代入逡逑标准曲线方程，得蛋白浓度（ｍｇ／ｍＬ）。将冻干的蜂王浆粉配成３０ｍｇ／ｍＬ的溶逡逑液
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S896.3

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本文编号：2709089