黏虫葡萄糖氧化酶和过氧化物酶基因cDNA的克隆及特性研究

发布时间：2020-06-14 15:15

【摘要】：维持生物体正常生命活动的生化反应有很多种,其中氧化还原反应是最为基础和重要的反应,催化该反应高效进行的酶类统称为氧化还原酶。氧化还原酶在生物体内具有多种生理功能,包括通过催化反应为机体提供能量、清除多余有害物质、活化大分子物质等。根据不同的氨基酸结构和涉及在不同生理活动中的活性,可以将氧化还原酶划分为很多种类型,其中葡萄糖氧化酶与过氧化物酶均是广泛存在于植物、动物与微生物体内的,具有抗氧化功能的氧化还原酶。葡萄糖氧化酶(GOX)是一种需氧脱氢酶,具有对β-D-吡喃葡萄糖特异性识别的特点,其功能是作为抗氧化剂降低生物体内的氧浓度,维持生物的正常生理活动;为厌氧菌创造有益环境,抑制有害菌的生长等。过氧化物酶(POD)是抗氧化酶系统主要组成酶中的一员,其功能是清除生物体内多余的活性氧,防止生物体内由于活性氧过多而引起一系列的氧化损伤,如破坏大分子物质结构、酶失活、脂质过氧化等。黏虫Mythimna separata是我国粮食作物上的重大农业害虫之一,具有暴食性和季节性长距离迁飞等为害特征,严重威胁粮食生产安全。其发生危害有以下几个特点:发生范围广,危害世代多;危害作物的种类和数量多;暴发性明显,可产生严重的产量损失;发生危害历史长等。目前对于黏虫GOX与POD基因的研究仍处于初级阶段,根据GOX与POD参与的氧化还原作用机制以及已知的昆虫GOX与POD的相关研究,猜想这两种酶参与的抗氧化酶系统是否与昆虫的消化作用、抑菌作用及受到逆境产生的保护性作用有关,进而可以利用RNAi技术沉默基因,使其功能受到影响,抑制昆虫的生理代谢活动从而达到利用生物技术防治害虫的目的。本试验以黏虫为供试材料,克隆获得两条全新的黏虫葡萄糖氧化酶基因MsGOX和过氧化物酶基因MsPOD的cDNA序列;分别对其核苷酸序列与氨基酸序列进行分析;研究在不同组织与不同龄期中两种基因时空表达水平的差异性;对黏虫进行不同浓度葡萄糖诱导处理和饥饿与复喂处理来探究MsGOX基因在昆虫取食方面发挥的作用;对黏虫进行不同时间不同温度的处理,探究MsPOD基因在受到极端温度诱导时产生的昆虫保护性作用;利用RNAi技术探究MsGOX基因沉默后对黏虫生长发育造成的影响,探究MsGOX基因沉默后对该基因抑菌作用的影响以及对苏云金芽孢杆菌侵染增效的作用,为利用该基因进行分子设计来防治黏虫奠定理论基础。主要试验结果总结如下:1.克隆获得一条新的黏虫GOX基因cDNA序列,该基因命名为MsGOX,基因登录号为KY348779。cDNA序列全长2187 bp,包含1个长度为1821 bp的开放阅读框,编码含有606个氨基酸的多肽,其分子量为66.4 ku,等电点为4.79。氨基酸序列分析显示该基因编码的氨基酸属于GMC家族,包括两个保守的蛋白结构域GMC_oxred_N和GMC_oxred_C,氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫氨基酸序列亲缘关系较近,与棉铃虫、甜菜夜蛾、谷实夜蛾和苜蓿夜蛾的一致性较高,达85%以上。克隆获得一条新的黏虫POD基因cDNA序列,该基因命名为MsPOD,基因登录号MH606240。cDNA序列全长2433 bp,包含1个长度为2061 bp的开放阅读框,编码686个氨基酸组成的多肽,其分子量为76.1 ku,等电点为5.68。氨基酸序列分析显示该基因编码的氨基酸具有一个HPXs细胞粘附蛋白结构域,属于过氧化物酶一环氧酶超家族,氨基酸序列比对显示,MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫氨基酸序列亲缘关系较近,其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高,为92%。2.探究MsGOX基因与MsPOD基因时空表达差异,分析在不同发育阶段与不同组织中不同基因在虫体内表达水平的变化情况。经试验及分析发现MsGOX基因在黏虫不同发育阶段与检测的不同组织中均有表达,其中在4龄时期和唾腺中表达量最高,在1龄时期和前肠中表达量最低。MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中也均有表达,在蛹期和唾腺中表达量最高,在1龄时期和前肠中表达量最低。3.探究MsGOX基因与昆虫取食作用的关系。对黏虫进行4种不同浓度葡萄糖溶液的处理,结果显示4种浓度的葡萄糖溶液均能诱导MsGOX基因的表达水平,并且越高浓度的葡萄糖溶液对MsGOX基因的表达水平影响越大,在葡萄糖浓度为10%时,该基因的表达水平达到最高;对黏虫进行饥饿处理,结果表明随着饥饿时间的增加,MsGOX基因的表达水平呈现先升高后降低的变化趋势,在处理24 h时表达水平达到最高;同时饥饿处理的黏虫进行复喂处理,结果表明MsGOX的表达水平有逐渐升高的趋势。探究MsPOD基因受极端温度诱导产生的昆虫保护性作用。对黏虫进行不同温度梯度与不同时间的处理,结果表明经温度梯度诱导后,MsPOD基因在不同时间点的表达水平具有显著差异,在35℃高温处理12 h后表达水平达到最高。4.探究MsGOX基因被干扰后对黏虫生长发育的影响。结果显示黏虫的体重、体长与消化系数均受到影响,在处理12 h后有明显的抑制作用。探究MsGOX基因被干扰后对该基因抑菌作用的影响。结果显示注射dsGOX的处理组黏虫中肠菌悬液制作的平板菌落数量大于注射dsEGFP的对照组黏虫中肠菌悬液制作的平板菌落数量,表明MsGOX基因的抑菌作用受到一定程度的抑制。探究MsGOX基因被干扰后对苏云金芽孢杆菌侵染黏虫的增效作用。结果显示进行苏云金芽孢杆菌侵染后,注射了dsGOX的处理组死亡率较注射了dsEGFP的对照组相比有所升高,说明黏虫抵抗苏云金芽孢杆菌的侵染能力在进行基因沉默后有所降低,对Bt菌有一定的增效作用。以上试验结果证明利用RNAi方法成功抑制了MsGOX基因的表达,并且发现MsGOX基因可能在黏虫的中肠消化中起到某种作用。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.4
【图文】：

示意图,催化反应,示意图,葡萄糖酸内酯

东北农业大学农学硕士学位论文右，具有很好的稳定性；最适温度集中在 30-60 ℃；GOX 在固体酶制剂的状态下于 0 ℃可稳定存在 2 年左右[16-17]。1.1.2 GOX 的作用机理GOX 通常与 CAT 以及辅基 FAD 结合形成氧化还原酶系统，进行催化氧化作用[18]。作用机理可以简单的概括为：β-D-葡萄糖分子通过辅酶 EFAD的作用生成 -D-葡萄糖酸内酯，辅酶 EFAD得到 β-D-葡萄糖分子中的氢原子后被还原为 EFADH2，之后 -D-葡萄糖酸内酯酸度缓释水解成 D-葡萄糖酸，同时 EFADH2再氧化为 EFAD，并生成 H2O2。由此反应过程可以看出，GOX 催化的反应产物同时也是生物体代谢反应必不可少的底物，并伴随着反应过程中的能量传递。催化反应过程如下（图 1-1）。

亚铁血红素,无脊椎动物,过氧化物酶,褐飞虱

前言有一定的作用。Park 等[70]克隆了 10 条甜菜夜蛾 POD 基因（SePOX A-J），并研究了该系列基因在昆虫细胞免疫反应中的作用。见煜坤[71]克隆了褐飞虱 Nilaparvata lugens 过氧化物酶基因，研究表明该基因在褐飞虱生命活动及生理代谢中起到重要作用，并且可能与褐飞虱的遗传变异有关。1.4.2 昆虫 POD 家族及相关功能Zamock 等[72]根据蛋白结构与酶活性的不同，将 HPXs 分为四个超家族（图 1-2）。

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