昆虫病原线虫共生菌的分离鉴定及次生代谢产物的研究

发布时间：2020-06-18 06:46

【摘要】：昆虫病原线虫-共生菌复合体对寄主昆虫具有快速致死的毒性,能够体外培养生产,具有良好的生产潜力,而且其寄主范围广泛,对植物、脊椎动物和多种无脊椎动物安全目前已成为国际上前景广阔的生物杀虫剂,广泛应用于农林卫生等领域的害虫防治。在昆虫病原线虫整个生命循环过程中,起关键作用的是线虫肠道内的共生菌,而共生菌在竞争生态位的条件下,产生诸多次生代谢产物,这些天然产物具有抗真菌、抗细菌和杀死昆虫等活性。昆虫病原线虫共生菌分离培养是获取次生代谢产物的重要途径,对于研发新一代生物杀虫剂具有重要意义,而分子生物学研究技术、基因测序技术及相关的生物信息学分析技术为研究昆虫病原线虫共生菌产出次生代谢产物的功能提供了技术保障。研究结果如下:1.本研究选择生态环境良好的场所采集土样,例如柞蚕生产基地、果园和耕地等。从辽宁省11个县共采集108个土壤样品,采用大蜡螟诱捕方法分离昆虫病原线虫,共分离到昆虫病原线虫40个样品,进而得到40株昆虫病原线虫共生菌,其中初生型菌株为10株。对10株初生型共生菌小规模发酵后,进行化学筛选,确定SN44菌株、SN52菌株为研究对象。2.通过传统的细菌分类法,结合16S r DNA之间的差异鉴别出供试的昆虫病原线虫共生细菌,其中的SN44菌株属于Photorhabdus luminescence subsp.Kayaii,SN52菌株被鉴定为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii BE)。3.从SN44菌株产生的化合物中,鉴定出3个次生代谢产物分别为IPS、Y15-2和Y-11。其中Y-11为首次从发光杆菌产物中分离获得。对培养出的初生型菌株展开平行的液体发酵,获取粗提物。通过TLC点板与液相分析方式,初步选择SN44菌株粗提物进行分离鉴定,得到2个化合物,Y15-2和IPS。IPS为二苯烯类化合物,具有抗真菌、细菌和杀虫活性。大发酵培养SN44菌株,获取粗提物,采用柱层析、TLC薄层制备和液相制备等手段进行分离提纯。纯样品通过1H NMR谱、13C NMR谱、质谱以及二维谱等信息,首次鉴定出由该属菌分离的化合物Y-11。以目前农药测试的模式昆虫之一—柞蚕为研究对象,以蛹期血淋巴酚氧化酶为靶标,对SN44菌株分泌的次生代谢产物IPS进行抑制酚氧化酶活性测定,IC50为50.8μg/m L。4.为了获取新的次生代谢产物,采用相同的技术流程和手段,选择SN52菌株作为研究对象,经过大量的柱层析和液相制备,从SN52菌株经液体发酵产生的粗提物中分离并纯化到4个化合物,经质谱分析和全面的核磁共振谱图解析,确定了化学结构为吲哚类衍生物,而且均是新化合物,命名为Xenocyloin G、Xenocyloin H、Xenocyloin I和Xenocyloin J。Xenocyloins G-J均具有显著的由胶原酶诱导的抗血小板凝集活性,Xenocyloin H活性最强,在浓度为50μM条件下,抑制率达到96.0±0.1%,Xenocylion G和Xenocylion H的IC50值分别为31.7±4.4μM,27.5±3.5μM。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.1
【图文】：

发光杆菌,生活史,昆虫病原线虫,侵染期

第一章昆虫病原线虫共生菌研究进展虫生长和发育。昆虫病原线虫经过 1 到 3 个生到新一代的侵染期线虫（Poinar & Thomas，196染期线虫从昆虫尸体迁出前，有 95%以上的线昆虫宿主资源后，侵染期线虫入土寻找新的宿，发光杆菌和致病杆菌演绎 3 个方面的功能。虫尸体生产营养，提供给线虫的生长和发育；通过北方线虫研究所拥有的 Olypmus DP80 生绘制昆虫病原线虫共生菌生活史，如图 1-1 所

生物合成基因,发光杆菌,功能定位,异丙基

图 1-2 二苯烯类化合物结构式Fig.1-2 Chemical structures of two benzenes图1-3 发光杆菌菌株TT01 生物合成基因及其功能定位，并提出异丙基二苯的生物合成路径。生物合成构建模块肉桂酸-CoA、丙二酰-CoA、异戊酰-CoA 与它们各自前体以黑体显示。Fig.1-3 Biosynthesis genes, their functional assignment, and proposed biosynthetic steps involved inisopropylstilbene biosynthesis in Photorhabdus luminescens strain TT01. The biosynthetic building blockscinnamoyl-CoA, malonyl-CoA, and isovaleryl-CoA as well as their respective precursors are shown in bold.注：引用于 Entomopathogenic Helge B Bode bacteria as a source of secondary metabolites. Bode, Helge B I（2009）.起初鉴定了一个色素（Paul et al.，1981）（图 1-4 a）。接着分离得到了一个红色的蒽醌类色素（Richardson et al.，1988）（图 1-4 b），当 pH 值>9 为红色，pH 值<9 为黄色。鉴定了一个色素（Sztaricskai et al.，1992）（图 1-4 c），有抗生素活性。分离鉴定的两个色素（Li et al.

【参考文献】