灰霉病菌诱导的草莓果实miRNA的鉴定及差异表达分析

发布时间：2020-06-21 14:35

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的单链RNA分子,在植物生长发育及各种抗逆响应中均发挥着重要的作用。目前,对植物mi RNA的研究已越来越深入,但关于miRNA对真菌响应机制的报道还不够广泛,尤其是草莓mi RNA。本研究以八倍体‘艳丽’草莓为试材,将灰霉病菌诱导后的红熟期草莓果实进行小RNA组测序,从而鉴定出感染灰霉病菌的草莓果实中的miRNA和靶基因,筛选出差异表达的miRNA,并对靶基因进行功能预测分析,以探究草莓miRNA对灰霉病菌的响应。主要结果如下;1.分别采用灰霉病菌处理后48 h(T1)、72 h(T2)、96 h(T3)和120 h(T4)的草莓红熟期果实,以及无菌水处理的草莓红熟期果实(CK1)和灰霉病菌(CK2)为试材,构建了六个小RNA文库,发现检测到的小RNA长度以21 nt为首。在六个文库中检测到隶属于58个miRNA家族的141个保守miRNA,以及35个新的miRNA。并对这176个miRNA进行靶基因预测,分别在保守miRNA和新miRNA中预测到506和287个靶基因,这些靶基因的种类主要是SPL,NAC,HL-Zip,TMV,LRR,F-box/kelch,MYB和一些抗病相关的基因。2.利用高通量测序技术,对灰霉病菌诱导的草莓果实miRNA进行差异表达分析,结果显示:与CK1相比,大部分保守miRNA和新miRNA在感病初期(T1、T2)是上调表达的,感病后期(T3、T4)又呈下调表达。选取其中6个差异表达miRNA(miR166a,miR167,miR5290a,fan-18,fan-20,fan-24),利用qRT-PCR技术进行表达量的验证分析,结果表明两种表达量分析方法检测到的结果基本一致。3.以‘艳丽’草莓果实为试材,采用RT-PCR技术成功克隆了草莓mi R5290a的靶基因PIRL,该基因编码区全长1554 bp,编码517个氨基酸。运用qRT-PCR技术分析了PIRL基因在灰霉病菌不同处理时间中的差异表达,发现其表达量下调,并在T2和T3时期的表达趋势与miR5290a相反,推测mi R5290a负调控靶基因PIRL的表达。4.以植物pRI101-AN为载体,通过添加内含子序列,以及两段反向互补的PIRL特异片段,利用Xbal I/Smal I和Kpn I/EcoR I限制性核酸内切酶,获得含PIRL特异片段的干扰载体。运用快速PCR定点突变技术,获得了mi R5290a的靶向位点消除,但翻译的氨基酸序列不变的mPIRL序列,在此基础上以植物pRI101-AN为载体,利用Nde I/Kpn I限制性核酸内切酶,获得含mPIRL编码区序列的过表达载体。5.利用农杆菌介导的遗传转化方法,获得了过表达mPIRL基因的3个转基因‘Ruegen’草莓株系。对3个转基因株系进行表达量检测,结果表明3个草莓株系中mPIRL的表达量远远高于对照,由此可推断3株均为转基因植株。6.将获得的含mPIRL过表达载体和PIRL干扰载体的菌液注射进‘艳丽’草莓的白果中,并在白果转红期用灰霉病菌菌液进行处理,观察表型发现:与无菌水处理的CK相比,mPIRL过表达的果实表型感病较轻,而PIRL干扰的果实表型感病较重。由此推测,PIRL参与草莓抗灰霉病的响应机制。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.68
【图文】：

流程图,文库构建,流程图,质量值

图 1 文库构建流程图Fig. 1 Flow chart of Library Construction息学分析得的原始序列进行质量检测和控制，将质量值低的、5’接头

文库,大小分布,小RNA,家族

图 2 六个文库中的小 RNA 长度大小分布Fig. 2 Size distribution of small RNAs in six libraries.这些 miRNA 家族中，miR1511（32 个），miR7782（23 个）和 miR159（大的家族，均含有 17 个以上的家族成员。另外，miR156（7 个），miR166（96（3 个），miR5290（3 个），miR319（2 个）以及 miR5289（2 个）也是含

【参考文献】