松材线虫多效耐药基因克隆及功能研究

发布时间：2020-06-22 18:59

【摘要】：松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种极度危险的入侵生物,由它引起的松树萎蔫病(pine wilt disease)是全球森林生态系统中最有危险及毁灭性的病害之一。我国自1982年在南京紫金山首次发现松树萎蔫病至今,已累计已损失数十亿株松树,造成的直接经济损失和生态服务价值损失达几千亿元。长期以来,针对松材线虫的防治主要依赖于化学农药,而化学杀线剂的长期过度使用会导致线虫产生耐药性,同时造成严重的环境污染。随着分子生物学的快速发展,药剂分子作用靶标的运用成为有害生物防治领域研究的热点。理想的药剂分子作用靶标是参与有机体重要功能的基因产物,通过基因沉默技术调节这类基因的表达量能显著影响有害生物正常生理机制,从而达到有害生物防治的效果。本研究以林业重要入侵物种松材线虫为研究对象,利用三种常用杀线剂,筛选出松材线虫多效耐药相关基因,利用生物学信息学及RNAi技术进行Bx-mrps基因功能分析,系统研究了 MRP家族中Bx-mrp1、Bx-mrp2、Bx-mrp3和Bx-mrp4基因对线虫耐药性相关功能的影响,对制定松材线虫新防治策略具有非常重要的理论意义。具体结果如下:1.测定了三种杀虫剂的杀虫活力并进行优化。本实验利用灰葡萄孢菌丝培养并扩繁松材线虫作为实验虫株,对苦参碱、阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐三种药剂溶剂进行筛选,进行室内毒力测定。结果发现:苦参碱药剂用ddH20溶解,阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐用二甲基亚砜作为溶剂效果最好;24 h时苦参碱、阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐三种药剂的LC50分别为4.0、0.15和0.10 mg/mL。2.研究了松材线虫多效耐药相关蛋白(MRP)生物信息学信息。本实验克隆并鉴定松材线虫MRP家族中Bx-mrp1、Bx-mrp2、Bx-mrp3和Bx-mrp4基因,利用生物信息学分别对四个基因所编码的蛋白质功能进行预测分析。结果发现:四种蛋白质均由C、H、N、O和S五种元素组成;蛋白质二级结构分析表明,各蛋白质中,α-螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲分别约占各基因所编码蛋白质二级结构总数的50%、15%、5%和30%;蛋白质亲疏水性分析及跨膜区域分析显示,四种蛋白质均为含有多个跨膜结构域的疏水性跨膜蛋白质;信号肽分析表明,除Bx-MRP3外,其他三种Bx-MRPs蛋白均无信号肽存在;糖基化和磷酸化位点分析表明这四个基因均含有多个糖基化位点及磷酸化位点;进化分析表明四种基因所编码的蛋白质均属于多效耐药蛋白家族;蛋白质三维结构预测表明Bx-MRPs均含有多个核苷酸结合域和跨膜结构域。试验结果初步明确了四种基因及其所编码蛋白质的结构特点及保守序列特性,为松材线虫MRP家族的研究提供了靶标基因,也为潜在药物靶标的筛选奠定了分子基础。3.明确了松材线虫Bx-mrps四个基因在松材线虫耐药胁迫及免疫防御方面的功能。通过体外合成松材线虫MRP家族四个基因的dsRNA,采用浸泡法对松材线虫进行RNAi基因沉默试验,对四个基因的功能进行初步研究。结果发现:目标基因dsRNA溶液浸泡处理后松材线虫响应基因的转录水平均明显下降,基因沉默效率较好。显微观察发现目标基因沉默后松材线虫表型活力下降,出现蜷缩、打结、颜色变暗、活动迟缓等现象。药剂生测实验表明Bx-mrps-dsRNA处理的松材线虫在三种药剂胁迫后的存活率显著降低。繁殖力测定结果表明,松材线虫多效耐药基因Bx-mrps被沉默后,松材线虫对灰葡萄孢的取食能力均有所降低。综上研究验证了 MRP家族四个基因在松材线虫中功能,明确了 MRP家族对线虫多效耐药的影响。为新分子靶标的筛选提供了依据,也为松材线虫的预防和治理提供新的思路。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.18
【图文】：

松材线虫,松树萎蔫病,森林生态系统,生活史

图１－１松材线虫的生活史（Ｋｉｋｕｃｈｉ，２０１１）逡逑１．３松材线虫的为害逡逑松树萎蔫病是全球森林生态系统中十分具有危险性和毁灭性的林木病害。松材线虫逡逑早发现于美国德克萨斯州的长叶松（Ｐ／ＷＷ＆邋ｐａ／ｚ？７／如）上；１９０５年，日本出现大量枯逡逑松树记录；１９７２年，Ｍａｍｉｙａ等认为导致日本松树萎蔫病的病原是松材线虫；１９８２逡逑，在南京紫金山的中山陵发现松材线虫，随后在江苏、浙江、安徽和广东等地区也发逡逑松材线虫，且为害相当严重；１９９８年，在葡萄牙也发现松材线虫的踪迹；２００９年，逡逑

异物,反应基团,松材线虫,酶作用

；ｉｏ／ｏ／Ｙ／．ｉｗｅｒａ、－、逡逑臭豆碱、槐胺碱、苦参碱等，均具有杀线虫活性［２２】。逡逑随着人们对健康、环保的要求大于对经济效益的需求时，新型、高效、无公害、无逡逑污染的绿色生物源药剂也就成为了社会和自然科学发展的必然，逐渐成为科研工作者的逡逑隹占。逡逑１．３线虫异物代谢通路研究进展逡逑异物代谢顾名思义是一种代谢途径，是指药物等大分子异物在生物体细胞内通过多逡逑种蛋白质和酶的代谢转化而排出体外的过程。生物体体内许多参与药物代谢的蛋白质和逡逑酶存在遗传变异性、遗传多肽性和不同的遗传表型，导致这些酶的含量或活性在不同生逡逑物个体间表现出明显差异，这些酶所介导的代谢途径在不同个体中就会出现很明显的差逡逑异。因此异物代谢相关的蛋白质和酶日益受到人们的关注。异物代谢通常分为三个阶逡逑段：修饰、共轭和排泄。三个阶段的蛋白或酶协同作用使异物从细胞中排出，达到抗药逡逑或解毒的功能在异物代谢过程中，Ｉ期代谢酶如细胞色素Ｐ４５０邋（ＣＹＰ）氧化亲脂毒逡逑素，然后通过ＩＩ期代谢酶如ＵＧＴ、ＧＳＴ进一步加工，催化添加官能团促进排泄。最逡逑后，修饰的毒素通过ＡＢＣ转运蛋白如Ｐ－糖蛋白、ＭＲＰ蛋白从细胞中排出【３（）１。逡逑

【参考文献】