TaSnRK2.1在小麦-叶锈菌互作过程中的功能研究

发布时间：2020-06-25 06:29

【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)叶锈病由专化性非常强的活体寄生真菌叶锈菌(Puccinia triticina)侵染引起,其爆发年代导致小麦大量减产,严重威胁粮食安全。本实验室长期从事小麦抵抗叶锈菌侵染的分子机制研究,在不亲和组合中,小麦通过过敏性反应-程序性细胞死亡(hypersensitive reaction-PCD,HR-PCD)来抑制叶锈菌的发育。实验室前期研究发现,小麦翻译控制肿瘤蛋白(TaTCTP)能够响应叶锈菌侵染,并参与HR-PCD的形成过程,对发生HR-PCD的细胞死亡进程具有正调控作用。为进一步研究TaTCTP在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的作用机制,本课题组前期借助TAP(串联亲和纯化)与质谱联用,鉴定出一个Ser/Thr蛋白激酶,可能作为TaTCTP的潜在互作蛋白。系统进化树分析发现该蛋白激酶属于蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)家族,与SnRK2.1亚家族蛋白同源度最高,因此我们将其命名为TaSnRK2.1。通过转录组数据分析发现,在小麦-叶锈菌不亲和组合(TcLr26×260)及亲和组合(Tc×260)中TaSnRK2.1在转录水平均上调,且在亲和组合中的转录水平高于不亲和组合,因此我们将其定为兴趣基因。利用基因克隆技术获得TaSnRK2.1编码区全长序列,随后分别对其功能和机制两个方面进行研究,在功能方面,我们首先分析TaSnRK2.1在不同亲和组合中的表达变化,随后进一步使用病毒诱导的基因沉默技术研究TaSnRK2.1对小麦抵抗叶锈病的影响。我们也通过GFP融合表达技术分析TaSnRK2.1的亚细胞定位。在机制方面,我们首先使用蛋白质互作技术研究TaSnRK2.1与TaTCTP的互作状态,进一步通过体外磷酸化试验分析TaTCTP是否可作为TaSnRK2.1的磷酸化底物。本试验获得的主要结果如下:1.通过实时定量PCR检测TaSnRK2.1在Tc和TcLr26接种叶锈菌生理小种260后的转录水平表达变化,结果显示TaSnRK2.1在接种叶锈菌后均有上调表达,且在Tc中相对表达量高于TcLr26,初步证明TaSnRK2.1基因参与小麦抵抗叶锈菌的过程。2.通过GFP荧光蛋白融合表达技术分析TaSnRK2.1在烟草表皮细胞中的分布状态,结果表明,TaSnRK2.1不仅存在于细胞质,而且在细胞核中也有分布。3.使用VIGS技术沉默TaSnRK2.1,结果显示,在亲和组合(Tc×260)中沉默TaSnRK2.1后,菌丝团面积相较于对照减小,表明叶锈菌的发育受阻,增强了植株抗性。在不亲和组合(TcLr26×260)中沉默TaSnRK2.1后,HR面积及吸器母细胞(Haustorial mother cell,HMC)数目相较于对照减少,也证明植株抗性增强。4.通过酵母双杂交(Y2H)技术初步分析TaSnRK2.1与TaTCTP能够发生物理互作。随后进一步通过双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)试验证明TaSnRK2.1能够与TaTCTP在植物生理条件下发生互作。双分子荧光互补结果显示,TaSnRK2.1与TaTCTP的互作同时存在于细胞核和细胞质,与TaSnRK2.1的亚细胞定位一致。5.体外磷酸化试验证明,TaSnRK2.1具有明显的激酶活性,然而TaSnRK2.1不能磷酸化TaTCTP,进一步研究发现TaTCTP抑制TaSnRK2.1的激酶活性。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.121.43
【图文】：

片段,大肠杆菌,引物

TaSnRK2.1片段扩增Figure1TaSnRK2.1fragmentamplification

叶锈菌,生理小种,小麦,侵染过程

图 2 TaSnRK2.1 分子系统进化树分析注：红色方框内即为 TaSnRK2.1Figure 2 TaSnRK2.1 phylogenetic tree analysisNote: TaSnRK2.1 is in the red box.小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的表达分析.1 在叶锈菌侵染小麦过程的表达变化，采用 qRT-PCR 分析表达量。在TaSnRK2.1非保守区设计特异性引物RT-SnRKTc 和 TcLr26 分别与叶锈菌生理小种 260 组成亲和及不亲d 左右）接种叶锈菌生理小种 260，并在接种后 0h、4h、 h、120 h 取样。以接种后 0 h 作为对照，利用 qRT-PCR 检，TaSnRK2.1 的相对表达量在亲和组合（Tc×260）和不亲和组 Tc 中相对表达量高于 TcLr26（‘*’代表 p≤0.05，‘**’果一致，初步推测 TaSnRK2.1 基因在小麦抵抗叶锈菌侵染

【参考文献】