水稻白叶枯病菌PXO99~A菌株MCP-free突变体的构建和趋化受体基因研究

发布时间：2020-06-26 16:21

【摘要】：大部分的黄单胞菌都属于植物病原细菌,能侵染多种植物,造成植物发生叶枯、叶斑、溃疡等症状。寄主植物包括了很多人类赖以生存的粮食、蔬菜和果木。本实验研究的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是水稻黄单胞菌的一个致病变种,该病菌菌体为短杆状,极生单鞭毛,革兰氏染色呈阴性,不形成芽孢,也不形成荚膜,菌体有粘性胞外多糖包围。水稻白叶枯病菌由叶片的水孔、伤口侵入,沿着叶脉维管束会产生灰白色的病斑,每年造成水稻严重减产,因此对水稻白叶枯病菌的研究是十分必要的。近年来,人们对水稻白叶枯病菌致病分子机理研究方面取得了一定进展,但是在黄单胞菌对寄主的识别机制方面的研究并不是很多,而水稻白叶枯病菌中的甲基趋化性受体蛋白(methyl-accepting chemotaxis proteins,MCP)在它对寄主的识别与早期侵染定殖中起着重要的作用,值得进一步研究。本实验致力于初步明确趋化受体基因在水稻白叶枯病菌中的功能,找出水稻白叶枯病前期侵染水稻的关键基因,为进一步研究趋化系统在水稻白叶枯病菌早期侵染及定殖中的作用奠定基础。本实验从水稻白叶枯病菌Xoo PXO99A全基因组水平出发,通过生物信息学的方法确定了候选的10个mcp基因以及一个疑似基因,主要使用同源双交换的方法对目标基因和基因簇进行突变,对mcp基因功能研究,得到如下结果:(1)全基因组搜寻mcp基因。MA结构域是一个典型的MCP蛋白结构域,因此本实验在全基因组的水平上扫描MA结构域编码区,确认了候选的10个mcp基因。它们分别是PXO_00036、PXO_00039、PXO_00041、PXO_00043、PXO_00045、、PXO_00046、PXO_00047、、PXO_00054、PXO_06142和PXO_04751。GenBanK数据中原注释为mcp基因的PXO_00916,其编码产物没有MA结构域,确认不属于mep基因。(2)完成构建mcp基因突变体和MCPfree菌株。设计各个基因号对应的引物,构建中间体质粒,通过三亲本接合或者电转化的方式把质粒导入到水稻白叶枯病菌野生型菌株PX099A中,采用同源双交换的突变手段,之后通过抗性筛选及PCR验证最终获得了水稻白叶枯病菌全部mcp基因的缺失突变体以及一个缺失了所有mcp基因的MCPfree菌株。之后利用分子克隆手段将mcp基因与质粒pXUK连接构建互补载体,并得到的相应的反式功能互补菌株。之后进一步逐个将互补载体互补到MCP free菌株中,观察该菌的表型及致病力变化,验证了mc 基因PXO_06142在水稻白叶枯病侵染过程中起着关键的作用。(3)对所有的突变体进行了基本表型的检测。实验表明:在所有的突变体中,基因号为PXO-0_041、PXO_00045的突变体游动性轻微下降,基因号为PXO_6142的缺失突变体和MCP free菌株游动性显著下降。基因号为PXO_4751、PXO_06142的缺失突变体和和MCP free菌株涌动性显著降低。PXO_04751缺失突变体抗渗透压能力减弱。(4)对所有的突变体进行了致病力的检测。发现在剪叶接种的情况下,各个突变体与野生型相比,致病力并没有表现出明显的差异。为了更加准确地检测各个突变体以及MCP free菌株致病力的变化,因此本实验采用非创伤型喷雾接种方法来检测各个突变体以及MCP free菌株致病力的变化。实验表明,在喷雾接种实验中,PXO_06142的缺失突变体和和MCPfree菌株的致病力较野生型显著降低。而将基因PXO_06142回补至MCP free菌株中,致病力能够补回。综上所述,本实验在构建单个基因缺失突变体后,发现基因PXO_06142对侵染水稻起着重要的作用,因此进一步构建了一个MCP free菌株并将各个基因逐一回补到MCP free中,然后逐个检测表型和致病力,进一步验证了基因PXO_06142的关键作用。得到以下结论:水稻白叶枯病病菌的mcp基因在该病菌的前期定殖与侵染中起着重要的作用,而在所有的mcp基因中,基因PXO_06142对表型和致病力有着显著影响,扮演着重要的角色。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.47
【图文】：

图１－１邋ＭＣＰ的结构与分类［１７］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＭＣＰ逡逑

内外引物进行候选菌株的ＰＣＲ检验。如果外引扩增产物的大小为目的基因左右臂之逡逑和，用内引验证无法扩增出条带，则可以说明相应的突变体己经构建成功。以／？＃基逡逑因为例，该基因的缺失突变体的验证如图３－６所示：逡逑４５逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 于慧敏;马玉超;;工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略[J];生物工程学报;2010年09期

2 梁景平;菌毛的类型及其作用机制[J];国外医学.口腔医学分册;1998年01期

3 郭亚辉;黄单胞菌属的分类研究进展[J];微生物学杂志;1997年04期

本文编号：2730569