番木瓜环斑病毒西瓜株系抗血清制备、抗性品种筛选及交叉保护

发布时间：2020-07-20 07:37

【摘要】：番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。根据寄主范围的不同,PRSV可分为P和W两个株系,其中W株系(PRSV-W)只侵染葫芦科作物,引起花叶和果实环斑等症状,严重影响作物产量和品质。近年PRSV-W在山东、河南等地区的发生呈上升趋势。本研究制备了PRSV-W抗血清,分析了葫芦科作物品种对PRSV的抗性,测定了弱毒突变体对野生型PRSV的交叉保护效果。主要研究结果如下:1、利用原核表达的衣壳蛋白制备了效价高、特异性强的PRSV抗血清。将PRSV-W衣壳蛋白(CP)基因连接到原核表达载体pEHISTEV上,获得重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta。经诱导可表达出约37 kD的蛋白,最适IPTG终浓度0.2 mmol/L、诱导时间4 h。经ELISA检测,抗血清效价为1:8192。Western blotting结果表明,该抗血清只与PRSV-W侵染的西葫芦有特异性反应,而与健康西葫芦、西瓜花叶病毒侵染的西葫芦和马铃薯Y病毒侵染的普通烟均无反应。2、通过室内接种试验鉴定了55个葫芦科作物品种对PRSV的抗性。在鉴定的13个黄瓜品种中,唐山秋美、精选唐山秋瓜、耐热王中王和辽研翠玉4个品种的病情指数分别为32.2、34.4、37.8和38.9,属于中抗品种,其余均为感病或高感品种;七叶早南瓜、瑞丽甜蜜本、日本南瓜和一品甜红栗的病情指数介于31.1与39.4之间,属于中抗品种。长丰肉丝瓜和常丰长香丝瓜的病情指数分别为50.5和54.4,属于感病品种。13个甜瓜品种、11个西瓜品种、11个西葫芦品种和2个瓠瓜品种,病情指数都在60以上,属于高感品种;3、测定了三个弱毒突变体对野生型PRSV的交叉保护效果。在保护间隔期为5天时,三个弱毒突变体均没有表现出交叉保护效果。在保护间隔期为10天时,挑战接种后15天,弱毒突变体N137A预先接种的西葫芦植株均无明显症状,保护效率为100%,与只接种野生型植株相比,预先接种N137A的西葫芦植株中病毒粒子的积累量显著降低;弱毒突变体N346A能够延迟发病15天;弱毒突变体V417A没有表现出交叉保护效果。在保护间隔期为15天时,N137A的保护效率为100%;N346A的保护效率为26.7%,V417A仍然无明显的交叉保护效果。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41
【图文】：

山东农业大学,硕士学位论文,切胶,分析物

山东农业大学硕士学位论文表达及抗血清的制备的扩增与测序分析物 Nco I-F 和 BamH I-R 对 PRSV CP 基基因片段，切胶回收后与原核表达载体，过夜连接后得到重组质粒 pEHISTEV测定证明其开放阅读框正确。

重组质粒,质量标准,切胶

切胶回收后与原核表达载体，过夜连接后得到重组质粒 pEHISTEV测定证明其开放阅读框正确。图 3-1 PRSV CP 基因的扩增Fig.3-1 PCR product of PRSV CP gene

浓度,蛋白,菌液,基因表达

V CP 的诱导表达及 SDS-PAGE 分析测序正确的 pEHISTEV-PRSV-CP 转化大肠杆菌 Rosetta，为了表达条件，菌液经不同的IPTG浓度和时间诱导后进行SDS-PAG明，除了未经 IPTG 诱导的菌液外，在不同的时间及 IPTG 浓度在 37 kD 附近表达出了蛋白条带（图 3-4 和图 3-3），与预期大 kD 蛋白是 PRSV-W CP 基因与原核表达载体 pEHISTEV 上的白酶酶切位点基因表达的融合蛋白。另外在 IPTG 的不同浓度CP 的表达量并未表现出明显的差异（图 3-3）；在不同诱导时蛋白在 1 h 时即可表达，随后表达量增加，但是在 4 h 后表达明显的变化（图 3-4）。所以我们将 IPTG 终浓度为 0.2 mmol/Lh 确定为 PRSV CP 的最适诱导表达条件。

【参考文献】