马铃薯Y病毒侵染过程中烟草CLC-Nt1蛋白的功能研究

发布时间：2020-07-21 18:07

【摘要】：马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)严重威胁茄科作物的生产,揭示PVY与寄主的互作关系,可为研究其致病机理及病害防治提供理论依据。前期研究发现普通烟(Nicotiana tabacum)编码的氯离子通道蛋白CLC-Nt1可能与PVY编码的6K2蛋白互作。本研究旨在通过多种生物化学与分子生物学手段,进一步揭示CLC-Nt1蛋白在PVY侵染过程中的作用机理,主要研究结果如下:(1)通过分段克隆以及无义突变的方法构建了PVY坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY~N)侵染性克隆PVY-S。该侵染性克隆可侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)、普通烟与番茄,并具有和野生病毒相似的致病力。在该侵染性克隆中分别插入表达了外源蛋白GFP、Rosea1及MtPsy2a,可直观监测PVY侵染进程,为研究PVY的致病机理提供一个有利工具。(2)通过病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、CRISPR/Cas9技术、回补实验等方法证明CLC-Nt1蛋白参与植株的生长发育。利用GUS染色进行组织特异性表达分析,表明CLC-Nt1基因在根、茎、叶及花中均表达。通过亚细胞定位分析,发现CLC-Nt1蛋白定位在内质网与COP II小泡。利用对pH敏感的荧光蛋白探针(pHluorin),证明CLC-Nt1蛋白参与调节内质网pH。利用secreted GFP(secGFP)证明CLC-Nt1蛋白参与胞内蛋白分泌途径。(3)通过酵母双杂交(Yeast two hybrid)、共定位分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)等方法,证明CLC-Nt1蛋白与6K2蛋白互作。利用对pH敏感的荧光蛋白探针,发现PVY侵染和单独表达6K2蛋白均可引起内质网pH升高。通过病毒介导的基因沉默、CRISPR/Cas9技术、化学抑制剂等方法,发现CLC-Nt1蛋白功能缺失后PVY的胞内复制以及系统侵染均受到抑制,表明CLC-Nt1蛋白是PVY侵染所必需的一个寄主因子。根据上述结果得出结论:PVY侵染普通烟后通过自身编码的6K2蛋白与普通烟的CLC-Nt1蛋白互作而调节CLC-Nt1蛋白功能,诱导细胞内质网pH升高,利于PVY募集复制囊泡组分,从而促进病毒胞内复制与系统侵染。本研究首次证明植物的CLC蛋白具有调节细胞器内pH的功能,并首次从胞内pH的角度分析植物病毒与寄主的互作关系,为今后作物抗病毒药物的开发提供新的思路。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41
【图文】：

光谱分析,蛋白

tCLCd（von der Fecht-Bartenbach et al., 2007）及 AtCLCf 蛋白等（Marmagne et a膜片钳技术在原位检测跨膜离子流；而在爪蟾卵母细胞中异源表达这些 CLC果并不完全可靠，这些技术障碍限制了对此类 CLC 蛋白功能的理解。根据序AtCLCd 蛋白可能是 Cl-/H+逆向转运蛋白而不是 Cl-通道蛋白（Zifarelli & Pusc同哺乳动物 CLC-4 及 CLC-5 蛋白一样参与调节细胞器内 pH（Hara-Chikuma euma et al., 2005b; Mohammad-Panah et al., 2009）。利用一种可以准确检测细胞料将有助于理解这些 Cl-/H+逆向转运蛋白在细胞中的作用。白分泌途径与细胞器内 pH 关系对pH敏感的荧光染料，例如：FITC（dextran-conjugated forms of fluorescein isotnn & Kosegarten, 1995）和 Oregon green（Christoph-Martin & Mühling, 2011），胞质外体 pH；BCECF（2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxy fluorescein）arboxy seminaphthorhodafluor）被用来测定细胞质和液泡内的 pH（Gehring e et al., 1997; Gonugunta et al., 2008; Krebs et al., 2010）。然而这些荧光染料常会

细胞器,拟南芥

士学位论文，并且不能特异性地区分不同细胞器，因此并不适用于检测内内 pH。除了荧光染料外，一些遗传编码的对 pH 敏感的荧光蛋白内细胞器 pH。Miesenbock 首先鉴定到一个 GFP 突变体（pHlu 和 470nm 两种波长激光激发出荧光，并且荧光强度比值随 pH 变曲线后可根据光强比值准确计算蛋白周围 pH（Miesenbock et al将 pHlurion 靶向至不同细胞器，实现无损伤、高特异性地检测不ere 利用 pHluorin 检测了拟南芥和烟草细胞内膜系统细胞器内 pH内 pH 呈梯度降低趋势；其中内质网是 pH 最高也是蛋白分泌途H 最低，如图 1.2（Martiniere et al., 2013; Shen et al., 2013）。

调控机制,细胞器,途径

国农业科学院博士学位论文第一章引研究表明蛋白分泌途径中细胞器内的 pH 对蛋白分泌的正常进行至关重要，当一种或多种器内 pH 平衡状态被打破时，蛋白质的加工与分泌进程将受到严重的影响。例如，用 monenmonovalent ion-selective ionophore，一价离子选择性离子载体）处理细胞，会引起反面高尔形态变化，破坏细胞器完整性（Mollenhauer et al., 1990）。进一步研究表明，monensin 会打面高尔基体膜内外质子梯度（Boss et al., 1984），抑制一些可溶性蛋白，如 phytohemaggluti及一些贮存蛋白前体的膜泡运输（Matsuoka et al., 1990; Gomez & Chrispeels, 1993）。反面高体内酸性环境改变还会影响可分泌蛋白翻译后修饰以及加工进程（Carnell & Moore, 1994），货物蛋白的目的地（Chanat & Huttner, 1991）。一些驻留蛋白，例如 TGN38 和 furin 的定Chapman & Munro, 1994），以及一些蛋白水解酶的运输与成熟同样依赖于细胞器内环境 Schmidt & Moore, 1995）。

【相似文献】