柞蚕凝集素基因克隆及表达分析

发布时间：2020-08-09 14:29

【摘要】：凝集素作为一种模式识别受体,在昆虫免疫系统中发挥着重要的作用,主要通过识别病原微生物表面的特定模式分子来激活昆虫免疫防御系统。不同的凝集素含有的特异性碳水化合物识别结构域CRD不同,能够识别的病原微生物表面特定模式分子也不同。其中C型凝集素是鳞翅目昆虫中凝集素的主要类型,是一种Ca~(2+)依赖的糖结合蛋白,对病原物表面的糖蛋白、糖脂都有较好的结合能力。本文以柞蚕凝集素为对象,对其序列特征、基因表达水平、重组蛋白的凝集活性进行研究,以期进一步明晰柞蚕免疫中模式识别受体—凝集素的功能及作用机理。1.本研究从柞蚕中肠转录组数据库中筛选出柞蚕凝集素相关序列,设计引物,克隆获得4个柞蚕凝集素基因Lectin、Lectin16、Lectin21、CTL,并对其氨基酸序列进行比对和生物信息学分析:Lectin开放阅读框(ORF)长度为678 bp,编码225个氨基酸,预测其等电点(PI)为6.30,蛋白分子质量(Mw)为26.11 kDa,1-19个氨基酸为信号肽;Lectin16开放阅读框(ORF)长度为708 bp,编码235个氨基酸,预测其等电点(PI)为6.63,蛋白分子质量(Mw)为26.99 kDa,1-34个氨基酸为信号肽;Lectin21开放阅读框(ORF)长度为801 bp,编码266个氨基酸,预测其等电点(PI)为6.70,蛋白分子质量(Mw)为30.13 kDa,无信号肽;CTL开放阅读框(ORF)长度为924 bp,编码307个氨基酸,预测其等电点(PI)为5.11,蛋白分子质量(Mw)为34.97 kDa,1-15个氨基酸为信号肽。2.利用半定量RT-PCR技术分析柞蚕凝集素基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个发育时期的时间表达谱和幼虫不同组织的空间表达谱。半定量RT-PCR检测基因表达谱表明,4个凝集素基因在柞蚕各组织中表达存在差异。其中CTL分布广泛,在除血浆和马氏管以外的各组织中均有表达。其他3个基因主要在血细胞、中肠、脂肪体和生殖器官中表达。3.利用实时定量PCR技术检测柞蚕幼虫中凝集素基因经柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)、柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus)、柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)4种病原微生物及大肠杆菌(Escherichia coli)诱导后不同时间点的表达水平变化。实时定量PCR结果显示经不同病原物及大肠杆菌诱导后柞蚕凝集素基因在血细胞和中肠中的表达量均有明显升高。经5种不同微生物诱导以后,凝集素基因在感染细菌后基因表达量变化最显著,其中感染大肠杆菌、核型多角体病毒后凝集素基因表达量变化最迅速,6-9 h高表达;感染微孢子虫以后凝集素基因表达量随诱导时长逐渐升高,在24 h后最高达;在链球菌的诱导下凝集素基因表达量在9 h升至最高,然后逐渐降低;感染白僵菌后24 h凝集素开始高表达。4.将克隆所得基因与原核表达载体pEASY~?-E1 Expression vector相连后转化到感受态细胞BL21(DE3),通过SDS-PAGE检测表明经IPTG诱导后重组质粒能够表达与预测蛋白质量相一致的融合蛋白。Western blot结果显示,纯化后的菌液能够杂交产生目的条带。凝集试验验证了重组蛋白对大肠杆菌、鼠血红细胞的凝集活性。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S884
【图文】：

图 2-1 柞蚕凝集素基因的 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测NAmark ，1-Lectin 扩增产物，2-Lectin16 扩增产物，3-Lectin21 扩增产增产物Fig. 2-1Agarose gel electrophoresisof ApLectingenesDNAmark，1-Amplification productof A.pernyi Lectin，2-Amplification16，3-Amplification productof A.pernyiLectin21，4-Amplification produCTL集素基因的序列分析及蛋白质序列同源比对蚕凝集素基因序列分析 我们获得了柞蚕 Lectin、Lectin16、列，经 SMART 在线分析这 4 个基因均有 C 型凝集素家族特有其中 Lectin、Lectin16 含有 1 个 CRD，Lectin21、CTL 含有 2 个析表明：Lectin 开放阅读框架长度 678bp，编码 225 个氨基酸6.30，蛋白分子质量（Mw）为 26.11 KDa，信号肽预测发现该分泌蛋白，保守结构域为 37 a~208 aa（图 2-2A 蓝色方框部分） 2-2A 红色斜体部分），无跨膜结构，预测可能为分泌蛋白（图6 开放阅读框架长度为 708bp，编码 235 个氨基酸，推测其等

沈阳农业大学硕士学位论文泌蛋白（图 2-3）。Lectin21 开放阅读框架长度为 801bp，编码 266 个氨基酸，推测其等电点（PI）为6.70，有 2 个保守结构域为 1 aa~107 aa、119 aa~257 aa（图 2-4A 蓝色方框部分），其蛋白的分子质量（Mw）为 27.13 KDa，无信号肽和跨膜结构（图 2-4）。CTL 开放阅读框架长度为 924 bp，编码 307 个氨基酸，推测其等电点（PI）为5.11，有 2 个保守结构域为 18 aa~146 aa、160aa~298 aa（图 2-5A 蓝色方框部分），其蛋白的分子质量（Mw）为 34.97 KDa，1-15 位为信号肽（图 2-5A 红色斜体部分），无跨膜结构，预测可能为分泌蛋白（图 2-5）。

图 2-3 Lectin16 的生物学信息分析A-Lectin16 氨基酸序列分析，B-Lectin16 亲水性分析C-Lectin16 信号肽分析，D-Lectin16 跨膜结构列分析Fig. 2-3 BioinformaticsAnalysis of Lectin16A-Amino acid sequenceofLectin16，B-Predictionofhydrophilicity and hydrophobicityof lectin16C-Predictionof signal of Lectin16，D-PredictionoftransmembranestructureofLectin16

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本文编号：2787246