芸薹根肿菌分子检测与田间时空动态分析

发布时间：2020-08-10 07:35

【摘要】：根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的一种土传病害,在世界范围内十字花科作物产区均有发生,造成严重经济损失。根肿菌在土壤中能够长期存活,使得根肿病的防控手段有限,导致该病害不断发生和蔓延。本研究采用分子生物学技术,初步建立芸薹根肿菌早期诊断方法和定量检测体系,用于监测田间时空动态变化,为研究根肿菌的成灾和根肿病的流行提供了理论参考及技术支持。主要研究结果如下:1.基于常规PCR技术建立根肿病的早期诊断方法。该方法能够特异性检测芸薹根肿菌DNA,而对代表性的真菌、细菌、线虫及寄主植物内生菌等没有扩增产物。灵敏性检测表明,根肿菌DNA最低浓度1×10~(-3) ng/μL,土壤带菌最低浓度为1×10~3个孢子/克土,种子带菌最低浓度1×10~5个孢子/克种子。同时,该方法能够用于多种十字花科作物(包括罹病油菜、白菜、茎瘤芥、甘蓝、萝卜)的根肿病早期诊断与预测,也能够用于不同播种阶段的油菜根部及其根围土壤的田间带菌检测。2.利用qPCR方法构建根肿菌定量检测体系。该体系能够用于根肿菌孢子及土壤、种子和罹病寄主植株的带菌定量检测。灵敏性分析表明,qPCR方法能够检测根肿菌孢子最低浓度为1×10~1个孢子,土壤带菌最低浓度为1×10~3个孢子/克土,植物(油菜、白菜和榨菜)带菌最低浓度为1×10~3个孢子/克根组织,种子带菌最低浓度为1×10~3个孢子/克种子。此外,比较发现不同样品的回归曲线呈平行关系,且样品浓度在1×10~5水平下,理论与实际浓度水平差异较小,且根肿菌孢子浓度与病情指数呈正相关。该检测体系具有评估田间根肿病的发生与流行预警的可能性。3.应用早期诊断和定量检测技术,监测田间根肿菌群体的时空动态。在时间动态方面,同一生长季内根肿菌的群体密度随时间呈先降后升趋势。在空间动态方面,根肿菌主要垂直分布在地下0?50cm范围内,并具有动态分布特点。其中,播种后4周根肿菌主要集中在20?40cm的土层范围内,8周则聚集在0?30cm的范围内。水平分布发现,田间根肿菌群体密度与病害发生具有相关性,存在分布集中区域(即病害热点),且经过一个生长季节后将出现新的潜在病害热点现象。本研究建立根肿菌的早期诊断方法和定量检测体系,初步实现田间根肿菌的精准检测及群体动态监测,为根肿病的早期预警及流行预测等提供理论参考和技术支持。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.3
【图文】：

退火温度,反应条件,模板,线虫

图 2 1 PCR 反应条件（退火温度）优化；3：54oC；4：56oC；5：58oC；6：60oC；7：62oC；8：611：70oC.1 Optimization of the annealing temperature in PCR 2: 52oC; 3: 54oC; 4: 56oC; 5: 58oC; 6: 60oC; 7: 62oC; 8: 64oC线虫等样品 DNA 作为模板进行 PCR 扩增，ssicae 模板 DNA 进行有效扩增且呈 PCR 阳及阴性对照均未出现扩增产物（图 2 2），说. brassicae 具有较高的特异性。

根肿,内生菌,模板,线虫

+图 2 1 PCR 反应条件（退火温度）优化C；2：52oC；3：54oC；4：56oC；5：58oC；6：60oC；7：62oC；8：64oC；9：66oC11：70oC.Fig 2 1 Optimization of the annealing temperature in PCR reactioner; 1: 50oC; 2: 52oC; 3: 54oC; 4: 56oC; 5: 58oC; 6: 60oC; 7: 62oC; 8: 64oC; 9: 66oC; 10异性微生物及线虫等样品 DNA 作为模板进行 PCR 扩增，结果表明菌 P. brassicae 模板 DNA 进行有效扩增且呈 PCR 阳性反应，、内生菌及阴性对照均未出现扩增产物（图 2 2），说明 PCR 根肿菌 P. brassicae 具有较高的特异性。

灵敏性,菌孢,根肿,孢子含量

沈阳农业大学硕士学位论文肿菌 DNA 定量后，分别稀释成不同 DNA 模 DNA 浓度下限为 1 pg/μl，同时扩增条带亮度模板 DNA 浓度在 100 fg/μl 及阴性对照无法进行菌孢子土样中提取的 DNA 作为模板进行 PCR壤中根肿菌孢子含量的灵敏性。该反应体系检103个孢子/克（图 2 4），而土壤孢子含量在 1×1增条带，表明 PCR 检测体系对根肿菌 DNA 及

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