茶树对茶尺蠖的抗性评价及其抗性机制研究

发布时间：2020-08-11 13:48

【摘要】：茶尺蠖作为茶园重要食叶害虫,其发生世代数多、繁殖快、容易暴发成灾,严重影响着茶树正常生长发育、茶叶的产量和品质。选育抗茶尺蠖的茶树品种可以从根本上解决茶尺蠖取食为害的问题。本研究通过对茶树叶片表型结构观察和叶片对茶尺蠖幼虫生长发育的影响,选取‘上梅州’作为抗虫品种(RG)和‘平阳特早茶’作为感虫品种(SG)进行虫害后茶树转录组测序和代谢产物分析,探究抗性品种对茶尺蠖产生抗性的分子机制,挖掘茶树关键抗性基因和次生代谢物,并对关键抗性基因家族进行生物信息学分析和表达模式分析,克隆了关键抗性基因并对其进行烟草的遗传转化。主要研究结果如下:1.通过观察‘上梅州’(MZ)、‘碧云’(BY)、‘龙井长叶’(LC)、‘九龙茶’(GL)、‘蓝山苦茶单株’(LS)、‘龙井43’(LJ)、‘白毫早’(BH)、‘茴香茶’(HX)、‘大方贡茶’(DF)、‘福云六号’(FY)、‘浙农113’(ZN)、‘平阳特早茶’(PY)这12个茶树品种叶片的内部结构,MZ、BH、HX、DF、GL、ZN这六种茶树叶片具有2~3层紧密排列的栅栏组织,而PY、FY、LC、LJ、LS、BY这六种茶树的栅栏组织有2层细胞组成,且排列松散。12种茶树叶片喂养茶尺蠖幼虫,发现幼虫对MZ、BY、DF和HX这五个品种的取食量明显少于PY,且幼虫增重量和取食量呈正相关。MZ叶片喂养的幼虫体重最轻,体积最小;PY叶片喂养的幼虫体积最大,生长状况最好。GL、PY品种的幼虫化蛹数比较高,HX、BY和MZ品种的幼虫化蛹数较低。在取食选择试验中,1龄幼虫对MZ和LJ有很大的选择性;2龄幼虫对MZ和FY具有较大的取食倾向性;3龄幼虫对LS、GL和HX具有倾向性,对MZ倾向性较小。幼虫对MZ的选择随着龄期的增加变小,对PY的取食选择随着龄期增加变化幅度不大。计算幼虫的取食选择指数,发现PY的取食选择指数最大,MZ的取食选择指数小于PY。因此,综合叶片解剖结构、幼虫食叶量和虫增重、幼虫取食选择和取食选择指数、以及化蛹数和死亡数,选取‘上梅州’(MZ)作为抗虫品种(RG)和‘平阳特早茶’(PY)作为感虫品种(SG)进行后续的研究分析。2.通过对茶尺蠖为害后的RG和SG代谢产物进行分析,分别找到了75和74个差异表达代谢物。这些代谢物主要包括类黄酮、氨基酸及其衍生物、脂肪酸、核酸及其衍生物。相较于对照植株,虫害后的茶树植株中类黄酮代谢途径活跃且代谢物含量增加。表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)和儿茶素(C)在RG中水平显著增加,同时山奈酚、花翠素、槲皮素、原花色素和原花青素在SG中水平显著增加;茉莉酸(JA)作为植物响应害虫侵害的重要植物激素,在RG中被大量诱导合成,而在SG中只有茉莉酸的羟基化衍生物被发现;虫害后,RG代谢中果糖的水平受到了显著抑制,而在SG中果糖含量呈极显著增加;RG中水杨酸(SA)含量很低,而在SG中SA被显著诱导合成。在差异代谢物富集代谢通路中,RG和SG的差异代谢物主要参与了类黄酮生物合成途径和苯丙烷类生物合成途径,可见这两个途径在茶树抗茶尺蠖反应中起着重要作用。3.RG和SG的对照处理和虫害处理的挥发物种类和释放量存在差异。茶尺蠖幼虫取食为害后,RG和SG的两个处理中挥发物的种类和释放量变多变大,其中β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、(2Z)-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane等萜烯类化合物和(E)-2-Hexenal、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol脂肪酸类衍生物的释放量显著增加。虫害后的植株中,β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、(2Z)-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane、(E)-2-Hexenal、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol的释放量RG要多于SG,且差异显著。其中,α-Farnesene、Squalene、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol等萜烯类化合物和脂肪酸类衍生物在虫害后的RG植株中释放量显著增加。4.本研究利用Illumina HiSeq2500测序平台对虫害后RG和SG的六个文库(Cs_P1、Cs_P2、Cs_P3、Cs_M1、Cs_M2和Cs_M3)进行测序,共得到了704,798,092条高质量的reads,获得了342961个unigenes,它们的长度介于201~15022 bp,平均长度594bp,N50长度为834 bp。注释到的unigenes有18456条,占所有unigenes的5.38%。93667(27.31%)条unigenes被成功进行了GO注释;51793(15.1%)条unigenes被注释到了KOG的26个类群中。获得14260条差异表达基因(padj0.05),其中7587条表达上调基因,6673条表达下调基因。茶尺蠖为害后,RG中的碳水化合物(淀粉和蔗糖,果糖和甘露糖)代谢和氨基酸(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐,半胱氨酸和蛋氨酸)代谢都比SG中活跃。另一方面,在RG中与类苯丙烷(二萜、类倍半萜和三萜类化合物生物合成)相关的代谢途径都很活跃且代谢物含量升高。相较于SG,RG的茉莉酸合成途径基因FAD7A-1、LOX2.1和JMT的表达量都很高;参与类黄酮生物合成途径的酚类和花青素生物合成的限速酶,PAL和LDOX在RG中表达量升高。另外,催化萜烯类化合物合成的关键酶类,萜烯合酶基因(TPS03、TPS04和TPS21)在RG中的表达量同样上升。7587条上调表达基因主要和脂类修饰、细胞表面受体信号通路、木质部发育和转运(离子跨膜转运、碳水化合物转运和修饰氨基酸转运)有关,同时也参与了磷酸化作用、代谢进程(己糖、氧化还原辅酶、木质素、类苯丙烷和类异戊二烯代谢)、防御反应(气孔关闭调节、对植食性昆虫防御反应和对其他生物的防御反应)和植物激素信号传导(脱落酸、细胞分裂素和茉莉酸)。蛋白互作网络分析中,997条基因成功映射到了拟南芥上,其中59个TFs和44个PKs被发现分别与894个节点和24294个边缘关联紧密。蛋白网络分析发现6个TFs(MYB308/108、WRKY41/75、NAC062、和MYC4)与61个其它基因相互作用紧密,33个PKs(LRR-RLK、Ser/Thr kinase、CDPK、和MAPK家族)和271个其它基因相互作用紧密。5.从茶树各个组织的转录组中,筛选得到149条NBS编码序列。这些NBS蛋白序列又被分为7个种类CC-NBS-LRR(52)、TIR-NBS-LRR(3)、CC-NBS(25)、TIRNBS(3)、NBS(20)、NBS-LRR(40)和RPW8-NBS(6)。经过生物信息学分析和基因表达量分析,选取Cs4100(CsNBS-1)和CS187031(CsNBS-2)进行全长克隆和烟草的遗传转化。6.CsNBS-1和CsNBS-2基因序列全长分别是3696 bp和3718 bp,都属于CNL类型,ORF区域分别长2748 bp和2706 bp,分别编码915和901个氨基酸。采用农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化,一共得到41株卡纳霉素抗性的阳性植株。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.711
【图文】：

茸毛,取食,昆虫,物理结构

食植物主要受到植物体外部物理结构和内部化学成分的影响，物理结构可以阻碍或减缓昆虫的取食，主要包括植物叶片的软硬程度、叶龄大小以及叶片表面附着物等，化学成分可以限制昆虫对营养的摄取，主要包括一些次生代谢物和他感化合物（朱麟 1998）。这些物质的存在，使昆虫在取食植物的时候，受到了一定的限制。1.1.2 植物表型结构对昆虫的抗性植物体茎叶表面的茸毛、角质层、表皮厚度硬度、细胞组成及部分组织的硅化程度等形态结构都会对昆虫形成积极的防御作用（Maxwell1980;Loprestietal2017）。茸毛作为植物表皮的附属物，具有能够保持水分、防卫和平衡植物体内外环境等作用，也是植物抵抗害虫的第一道防线，体表茸毛的性状、长短和密度会在一定程度上影响到昆虫的附着、取食行为和产卵等（钦俊德 1987）。如棉花叶面和叶柄上的茸毛可以阻碍棉红铃虫初孵幼虫的爬行（Smith2005）；大豆叶片上布满的密生的茸毛可以阻碍蚕豆微叶蝉的取食（Taylor 1956）；马铃薯叶片表面的腺毛可以阻拦桃蚜的取食（Lapointe 1986）。作

生物功能,绿叶,挥发物,生物合成

强、过氧化氢酶活性下降（苟长青 2018）。害诱导植物挥发物 HIPVsHIPVs 的形成害诱导植物挥发物（Herbivore-induced plant volatiles, HIPVs）作为间接防性研究中具有重要的意义。在多种多样的生态系统中，HIPVs 能够调节植生物、未受害的紧邻健康植物或者未受害部位之间的相当大量的相mura et al 2009）。它是植物-昆虫-天敌三者之间协同进化的结果。植物在受害后，害虫口腔分泌物效应子侵入植物细胞，诱导植物释放大量的挥发性发物具有引诱害虫天敌的目的。HIPVs 在影响害虫取食行为的作用上较为遭受害虫危害后，植物体会产生一些具有抗虫性的次生代谢物，为了避免争和天敌昆虫，害虫会避开虫害植株去选择寄主，如小麦被高密度的蚜虫危

模式图,字型,模式,抗性基因

1.3.1 NBS 类抗性基因的发现和鉴定Biezen 和 Jones（1998）在研究调控秀丽隐杆线虫细胞程序性死亡的基因（ced-4）时，发现该基因和大多数植物抗病性基因具有相同的结构，即核酸绑定位点（NBS）和亮氨酸拉链区域（LRR）。在过去的研究中，已经在多种植物体内发现和分析了大量的 R基因（Dangl & Jones 2001）。NBS-LRR 抗性基因占 R 基因的很大一部分，达到 60.8%（Funk et al 2018）。在病原侵入位点，抗性基因产物能够造成迅速的局部宿主细胞程序性死亡，且用肉眼就可以观察。作为植物抗性机制的关键组成部分，大量的抗性基因都有一个共同的特征：核酸绑定位点（nucleotide-binding sites, NBS）和亮氨酸拉链区域（leucine-richrepeatregion,LRR）（McHaleetal2006）。NBS 区域能够绑定水解三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate,ATP）和三磷酸尿苷（Guanosinetriphosphate,GTP），在抗性信号传导途径中起作用（Takken et al 2006; Tameling et al 2006）。由于 NBS 结构域具有高度的保守性，因此常用来作为鉴别 NBS-LRR 类基因的依据。

【参考文献】