人血小板衍生生长因子（PDGF-BB）重组蚕丝的遗传改良与功能研究

发布时间：2020-08-13 03:27

【摘要】：家蚕(Bombyx mori.)是重要的农业经济昆虫,家蚕丝腺合成分泌的蚕丝是丝绸行业的核心原料与蚕桑产业的基础,是家蚕经济价值的集中体现。近年来,家蚕遗传操作技术的研究突飞猛进。随着家蚕基因组图谱的成功绘制、蚕丝蛋白合成与分泌机制的解析,目前,以家蚕丝腺与蚕丝为载体,利用遗传操作技术生产功能性外源蛋白、改良功能性蚕丝材料的研究已成为主流,其不仅能稳固蚕丝当前的应用市场,还可以扩展蚕丝的应用领域。基于以上研究背景,本研究在家蚕丝腺与蚕丝中重组表达了人血小板衍生生长因子(PDGF-BB),创制出了更强的促细胞增殖活性的新型蚕丝。具体研究结果如下:一、转PDGF家蚕的获得及分子检测人血小板衍生生长因子(PDGF)属于糖蛋白二聚体家族,存在于人血小板颗粒中,具有强趋化活性及分裂源性,可在伤口愈合、血管重塑及骨修复等多种生理过程中发挥重要作用。研究结果如下:1)人工合成PDGF-BB基因并构建家蚕转基因表达载体,AscⅠ酶切鉴定结果显示,已成功构建了表达载体piggyBac[3xp3EGFP,hSPDGFSer1PA];2)将PDGF-BB表达载体显微注射后对后代进行荧光筛选,获得了5个阳性蛾圈,阳性率为38%;3)基因组PCR结果表明PDGF基因已成功插入家蚕基因组,利用反向PCR确定其插入位点为26号染色体Bm_scaff 25;4)RT-PCR结果显示,在转基因家蚕中PDGF基因成功发生转录,同时内源Ser1基因的转录水平与正常家蚕相比下降了37.5%;5)从26个上蔟的阳性家蚕个体蚕丝中提取蛋白进行SDS-PAGE电泳,出现特异条带,大小与理论大小一致;Western Blot结果表明该处蛋白可与PDGF抗体特异结合,同时可检测到蛋白二聚体结构。二、转PDGF家蚕蚕丝中重组蛋白的分离纯化与活性检测PDGF蛋白具有促进细胞迁移与增殖的活性,为了验证重组表达的PDGF蛋白是否具有活性,对转PDGF家蚕个体茧壳中的重组PDGF蛋白进行了纯化及蛋白活性检测。研究结果表明:1)使用尿素提取出蚕丝中的丝胶蛋白,根据PDGF蛋白具有肝素结合域的结构特点,采用HiTrap~(TM) Heparin HP层析柱进行肝素亲和层析,得率约为80%;为了提高纯化产物的纯度,采用HiTrap~(TM) SP HP阳离子交换柱结合杂蛋白,得率约为70%;采用HiTrap~(TM) Q HP阴离子交换柱结合杂蛋白,收集流穿液,最终得到纯度为82.3%的PDGF蛋白溶液。整个过程可从1g蚕丝中获得0.2mg重组蛋白;2)利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行12h的饥饿处理,加入纯化的重组蛋白及等量标准品处理24h。EdU染色与CCK-8细胞增殖检测结果表明,与对照组相比,纯化的PDGF蛋白可维持NIH/3T3细胞的生长并促进细胞增殖,其活性与等量的标准品相比无明显差异;3)利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行12h的饥饿处理,用无菌枪头在细胞表面进行划痕,随后加入纯化的重组蛋白及等量标准品处理24h。与对照组相比,加入纯化的PDGF蛋白可显著减小划痕的面积,同时迁移出的细胞数量明显多于对照组,说明纯化的PDGF蛋白可以促进NIH/3T3细胞的迁移,其活性与等量的标准品相比无明显差异。三、转PDGF蚕丝素材的功能研究当机体组织出现破损时,血小板释放的PDGF可作为分裂源促进多种细胞增殖,加速伤口愈合。本研究通过家蚕丝腺生物反应器在蚕丝中特异表达PDGF蛋白,期待赋予蚕丝新的生物学活性,创制出功能性蚕丝素材。研究结果表明:1)PDGF重组蚕丝在外观形态、纤维直径、二级结构含量以及力学性能等方面,与正常蚕丝相比没有显著性差异;2)使用PBS可从PDGF重组蚕丝中提取出重组蛋白,持续提取20天,从90mg重组蚕丝中能够缓慢、持续地释放出13.7μg的PDGF蛋白,占到重组蛋白总含量的45.65%;3)利用血清浓度为10%的培养基培养细胞,PDGF重组蚕丝处理细胞24h后细胞生长状态良好,无明显死亡,不具有细胞毒性;4)利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行12h的饥饿处理,加入正常蚕丝、PDGF重组蚕丝与等量标准品处理细胞24h,EdU染色与CCK-8细胞增殖检测的结果显示,与对照组相比,PDGF重组蚕丝不需经过处理,便可维持NIH/3T3细胞的生长并促进细胞增殖,其活性与等量的标准品相比无明显差异;5)利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行12h饥饿处理,加入正常蚕丝、PDGF重组蚕丝与等量标准品处理细胞24h,Western Blot检测结果显示,PDGF重组蚕丝不需经过处理,可激活ERK通路从而促进NIH/3T3细胞的增殖,其活性与等量的标准品相比无明显差异。综上所述,本研究利用家蚕丝腺生物反应器,以及高效率的转基因表达系统,获得了可在家蚕丝腺及蚕丝中重组表达有活性的PDGF蛋白的家蚕品系,遗传改良出了可促进细胞增殖的功能性蚕丝材料。利用该重组蚕丝材料,有望制备出医用伤口敷料,促进伤口愈合,在生物医药、组织工程等领域具有极大的应用前景。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S88
【图文】：

组合形式,受体,亚基

及促进胞外基质合成等在内的多种演着重要的角色。长因子受体及信号通路F receptor，PDGFR）属于酪氨酸激，为单链跨膜糖蛋白，存在于多种类形式的亚基，亚基间两两结合可形DGFR-ββ 与 PDGFR-αβ，其结构包括。F-AA、PDGF-BB 和 PDGF-AB 这三与 PDGF-BB 和 PDGF-AB 相互作用而或者自分泌的形式分泌出去，会与受体活化后形成二聚体，自身发生磷相关信号转导通路将信号传递至细细胞的增殖或迁移[3]（图 2）。

信号通路

图 2 PDGF 信号通路[2]Figure 2 PDGF signal pathway生长因子的应用DGF 沉默不表达，当出现创伤或炎症等过细胞等细胞类型中表达组成型，从血小板 PDGF 具有强的趋化活性及分裂源性，可有丝分裂的过程，从而应用于多种领域。于促进伤口愈合。由两条 PDGF-B 链组成图 3）中最早出现的物质之一，对于血管，PDGF 通过与细胞表面的 PDGFR 结合直接作用，在伤口愈合过程中出现的众多因生长因子 β（transforming growth factor betfibroblast growth factor，FGF）等[5]，PDG同作用，加速伤口愈合。

过程图,伤口愈合,过程

图 2 PDGF 信号通路[2]Figure 2 PDGF signal pathway生生长因子的应用 PDGF 沉默不表达，当出现创伤或炎症等过程肌细胞等细胞类型中表达组成型，从血小板颗于 PDGF 具有强的趋化活性及分裂源性，可以胞有丝分裂的过程，从而应用于多种领域。于促进伤口愈合。由两条 PDGF-B 链组成的（图 3）中最早出现的物质之一，对于血管平子，PDGF 通过与细胞表面的 PDGFR 结合直直接作用，在伤口愈合过程中出现的众多因子生长因子 β（transforming growth factor beta，（fibroblast growth factor，FGF）等[5]，PDGF协同作用，加速伤口愈合。

【相似文献】