桑树皱叶病毒NASH及实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2020-08-20 17:27

【摘要】：桑树是桑属的多年生木本植物,在中国拥有悠久的栽培历史。桑叶不仅是蚕桑的重要原料,也可作为中国的传统中药,具有抗凝血和降血压的效果。桑树在自然生长过程中易受病原物侵扰,发生病害。桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年报道的一种新的双生病毒,在全国很多蚕区有报道,其与桑树皱叶病的相关性还未通过柯赫氏法则确定,所以其对桑树的危害无法进行评估。由于缺乏有效的化学药剂用于植物病毒的防治,早诊断、早处理是目前防治病毒病通过苗木传播的有效方法,所以建立高效、高灵敏度且简单的检测体系可以有效的预防MCLV的传播。本文的研究内容包括桑树皱叶病毒NASH检测方法的建立和应用以及桑树皱叶病毒实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测方法的建立和应用。1、桑树皱叶病毒NASH检测方法的建立和应用:使用非放射性物质地高辛作为标记物,通过随机引物标记法获得具有高灵敏度和特异性的DNA探针,通过优化杂交时间以及上样量,建立了桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)的核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)检测体系。与PCR检测结果相比建立的NASH检测体系准确率达93.1%。利用建立的NASH技术对江苏省镇江市3个不同地块(A、B、C)采集的60个桑叶样品进行检测以分析该病毒在该地区的分布情况及与桑树病毒样病害的关系,结果显示,A地块检出率20%,B地块检出率90%,C地块检出率95%,平均检出率68.3%,说明MCLV在该地区分布广泛;另外,在某些无任何病毒样症状植株上检出MCLV,而在某些有明显花叶或萎缩症状的植株上未检测出MCLV,说明MCLV可能与桑树上的花叶或萎缩症状无明显关联。2、桑树皱叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用:根据MCLV外壳蛋白序列,设计特异性引物,以MCLV阳性的桑叶样品提取的总DNA为模板,通过PCR获得了MCLV cp基因的全长序列(738nt)。经克隆及测序,确定该序列与GenBank登录(KR131749)的MCLV cp基因的序列完全一致。根据获得的cp基因的全长核苷酸序列,设计了3对用于qPCR的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒作为模板,通过PCR筛选出2条引物适合用于real-time PCR。以含有cp基因全长序列的重组质粒作为qPCR的标准品,对标准品进行10倍梯度稀释。以梯度稀释的样品为模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR构建标准曲线。结果显示,其中1条引物构建的标准曲线回归方程为y=-3.433x+12.925,扩增效率为95.6%,相关系数为0.998;熔解曲线只有一个特异峰,并且没有明显的引物二聚体或非特异性扩增峰,证明该引物具有特异性;通过计算,构建的real-time PCR对MCLV检测灵敏度≥47.8 copies/μl,每个梯度样品的变异系数均小于1.56%。说明标准曲线可信,该条引物特异,检测灵敏度高,重复性好。而另一条引物因为构建的标准曲线不能形成线性关系而不适合用于qPCR。利用qPCR对大田样品检测结果显示,15个样品都为MCLV阳性,结果与常规PCR检测结果一致。实时荧光定量PCR不仅可用于田间大量样品的检测,还可对样品中MCLV进行定量分析,比PCR检测更具有优势。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S888.7

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本文编号：2798240