烟草靶斑病菌毒素活性成分鉴定及其致病机制研究

发布时间：2020-08-22 04:11

【摘要】：烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)是近年来在我国发现的由立枯丝核菌引起的一种叶斑类新病害,造成的经济损失巨大,其病原菌R.solani可通过产生毒素引起致病作用。本文对该病菌的产毒素发酵培养条件、毒素的活性成分和致病机理进行了深入研究,结果如下:1.广泛采集云南普洱市和临沧市烟草种植区大面积发生的烟草靶斑病病叶标本60余份,采用常规组织分离法获得68个菌株。比较不同致病力烟草靶斑病菌菌株的产毒能力,发现菌株产毒能力越强,其致病力也越强。选择强致病力菌株SJ-8作为试验材料,从发酵液种类、发酵时间、发酵温度、pH值、光照条件、发酵方式、接种量和培养体积等影响因素对烟草靶斑病菌产毒发酵条件进行了初步筛选。从试验数据可知,采用改良的理查氏(Rhichard)培养液、于28℃、培养时间7天,pH值为7、光照与黑暗交替、间隔6h振荡一次发酵液、接种量体积百分比为10%和培养体积为100ml为发酵液最佳产毒培养条件。2.采用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法对烟草靶斑病菌毒素进行分离纯化,结合红外光谱(IR)、质谱(MS)、元素分析以及核磁共振(NMR)等分析方法明确了毒素结构。结果表明,经TLC最佳展开系统95%乙醇:浓氨水:乙酸乙酯=10:1:1,获得粗毒素;通过制备型HPLC对其再进行分离纯化,得到具有较高致病活性的精毒素组分Ⅰ和组分Ⅴ。经红外光谱、元素分析、质谱检测及核磁共振谱等技术手段分别对毒素组分Ⅰ和Ⅴ进行结构鉴定:毒素组分Ⅰ经红外光谱检测后得知其结构中含单取代苯、二烷醚(ROR’)、~+P-Ar、-CH_2-和-OCH_3结构等,由元素分析和质谱检测可知其磷盐正离子的分子量为307,结合核磁共振~1H-NMR分析、~(13)C-NMR和各种二维核磁谱结果,最终分析出毒素组分Ⅰ为甲氧基甲基三苯基氯化磷(C_(20)H_(20)ClOP)。毒素组分Ⅴ经红外光谱检测数据可知其结构中含羧酸(-COOH)、1,3-二取代苯、芳烷醚(ArOR)、-CH_2-和-OCH_3结构等,根据元素分析和质谱HRMS检测结果可知[M-H]~-峰的测定质量为165.0546,再结合核磁共振~1H-NMR分析、~(13)C-NMR和各种二维核磁谱,鉴定明确毒素组分Ⅴ为3-甲氧基苯乙酸(C_9H_(10)O_3)。3.为明确烟草靶斑病菌毒素的致病机制,本文研究了不同浓度3-甲氧基苯乙酸和甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素对烟草活性氧代谢、叶绿素含量及对叶片细胞超微结构的影响。活性氧试验结果表明,烟草叶片在分别被两种毒素及两种毒素混合组成的混合组分处理过后,激发叶片产生防卫反应。叶片内活性氧代谢增强,O~(2-)产生速率和H_2O_2产生量都有很大变化。叶绿素含量测定结果表明:经3-甲氧基苯乙酸和甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素分别处理3d后的烟草叶片,其叶绿素含量均有所下降。且叶绿素含量降低百分比随着毒素浓度增大而变大。电镜观察结果表明:经3-甲氧基苯乙酸毒素处理12h时,叶肉细胞中线粒体脊的数量减少;内质网断裂。处理36h后,叶绿体的片层结构出现局部裂解;且线粒体开始裂解,脊基本消失。48h时,可观察到叶绿体膜、基质、线粒体完全消失;部分叶绿体仅残留少量片层结构。经甲氧基甲基3-苯基氯化磷毒素处理叶片12h后,线粒体脊变粗;叶绿体的局部片层结构开始裂解。处理36h后,线粒体呈空泡状,且脊数量变少并裂解;叶绿体片层结构几乎全部裂解。48h时,细胞质壁分离严重;叶绿体膜、片层结构及线粒体完全消失。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.72
【图文】：

图 2-1 烟草靶斑病菌培养形态图（示菌丝）Figure 2-1 Morphology of the pathogen of tobaccotarget spot disease. Coenocytic mycelium图 2-2 病斑上观察到病菌的子实体（示担孢Figure 2-2 Hymenium of the pathogen obserthe lesions.Basidiospora表 2-2 立枯丝核菌的分离株及其来源Table 2-2 Isolates of Rhizoctina solani and their sources

图 2-1 烟草靶斑病菌培养形态图（示菌丝）Figure 2-1 Morphology of the pathogen of tobaccotarget spot disease. Coenocytic mycelium图 2-2 病斑上观察到病菌的子实体（示担孢Figure 2-2 Hymenium of the pathogen obserthe lesions.Basidiospora表 2-2 立枯丝核菌的分离株及其来源Table 2-2 Isolates of Rhizoctina solani and their sources

从图 2-3 可明显看出，烟草靶斑病菌 SJ-8 在供试的五种培养液（ard 培养液、PD 培养液、PS 培养液、Fries 培养液和 Czapek 培养液毒素，但在改良 Richard 培养液中产生毒素量最强，病菌在其中生接种叶片产生的病斑直径最大，可达 84.35mm。其次是在 PD 和 病菌产生的毒素接种叶片病斑直径大小分别为 73.21mm 和 68.32m次之，毒素接种叶片产生病斑直径为 43.87mm；而病菌在 Czapek的毒素接种叶片产生的病斑直径最小，病斑直径为 32.65mm。因此 Richard 培养液为烟草靶斑病菌产毒的最佳培养液。

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本文编号：2800245