浙江楠木枝枯病病原菌鉴定及系统发育分析

发布时间：2020-09-02 11:26

　　楠木是中国从古至今的深受人们喜爱的名贵树种,有着巨大的使用价值及生态意义。近年来在浙江省楠木种植区发现一种新型枝枯病害,枝条被侵染后出现黑褐色病斑,病情加重后分杈处肿胀并纵向开裂,严重的感病植株全冠幅枯死。发病区平均发病率为63.72%,平均病情指数为29.17,楠属Phoebe Nees、润楠属Machilus Nees树种均被发现感染此类病害,病情较为严重。本研究进行了大量的研究实验,调查分析了病害发生的规律及影响因素,对病害致病菌进行了分离鉴定,对其的生物学特性进行了探究,结果为今后楠木枝枯病的科学防控提供有效理论指导。结果如下:1.该种病害4月初~5月中旬在林间零星发生,6月~9月底为高发期,研究数据可知在立地条件变化的情况下楠木枝枯病的发病率和病情指数也会有显著性的变化,包括树高、坡向等,但是显著性差异并不表现在坡位不同、郁闭度指数不同的样地之间的发病率和病情指数上。种植在半阳坡和半阴坡的楠木其枝枯病发病率以及病情指数要比种植在阳坡和阴坡的楠木要高。5年以上树龄的楠木发病率以及感病指数较高,其中5年~30年的楠木病情最为严重。林分密度越大的楠木种植林发病率以及感病指数越高。树高1 m以上的楠木与树高1 m以下的楠木发病率以及病情指数差异性显著,其中树高1 m至5 m的楠木病情最为严重。单一品种楠木纯林和多品种楠木混合种植的林地发病程度要比楠木与其他树种混合种植的林地严重。2.分离纯化后比较其形态及培养特性,将分离得到的菌株分为两组,分别编号为JDHNY1为优势菌种,分离率为68.32%;JDHNY2为23.46%。对JDHNY1、JDHNY2进行致病性测定,JDHNY1能够引起健康楠木枝条发病,分离纯化后依旧能得到JDHNY1。使用ITS序列及EF1-α序列对JDHNY1进行形态学以及生物学鉴定,将所得序列上传至NCBI,获得登录号MK040561以及MH663527。并筛选下合适的载参比序列。结合系统发育树及培养特性可知,假可可毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae为楠木枝枯病病原菌。3.病原菌在以葡萄糖为碳源的处理下菌落直径扩展速率最快,葡萄糖为假可可毛色二孢最适碳源;以硫酸铵为氮源的处理下菌落直径扩展速率最快,硫酸铵为假可可毛色二孢最适氮源;PDA培养基上菌落直径扩展速率最快,PDA培养基最适合假可可毛色二孢;病原菌在10℃低温条件下也能发育,最适温度区间为25℃~35℃,假可可毛色二孢属于高温适生菌;不同光照条件对于假可可毛色二孢发育的影响并不明显;假可可毛色二孢在pH值5~11之间均能生长,最适pH值为5~6。这是Lasiodiplodia pseudotheobromae引起楠木枝枯病的首次报道;楠木为假可可毛色二孢的新寄主;同时也是假可可毛色二孢少数几则在南亚热带以外的气候区域被发现的报道之一。
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S763.7
【部分图文】：

枝枯病,楠木,症状

6 月～9 月底为高发期，品种单一的楠木种植林大多爆发式发生，受害枝比例高达 50%～100%，病情严重的林分全林树冠枯萎。2017 年至 2018 年对楠木枝枯病主要发病区长期跟踪观察后，总结主要发病症状如下：该种病害主要危害 5～30 年长势较弱的楠木，各个楠木品种均有出现该种病害发病症状，该种病害主要侵染 1～3 年生侧枝或者是树梢部位的枝段，侵染后发生病变的部位大多集中于枝条基部和分杈处，枝条受病原物侵害后，发病初期枝条表皮出现黑褐色水渍形病斑。随着病情的发展病斑会逐渐扩大，该段枝条上的树叶会逐渐萎蔫发黄病害加重后当年生枝条枯死，观察病斑横切面发现树皮韧皮部，内皮部甚至木质部出现不同程度的病变发黑，严重处可达木质部2～3 cm。发病后期多年生枝条发生病变的韧皮部出现增生肿大的症状，肿胀部位会再沿枝条方向开裂形成多条裂纹，部分梢端主干上会形成瘤状物,树叶基本枯黄脱落，枝条干枯严重着会整枝断裂脱落。整个病害过程中并未发现叶片出现病斑，病变部位未发现虫孔、虫眼、木屑、排泄物等蛀干害虫危害的痕迹，发病过程中无分泌物流出。但次年能从存活的主干上抽出新梢，新梢其生长正常无异。目前所发现病害都发生在海拔 300～20 米区域。

形态特征,菌种

浙江楠木枝枯病病原菌鉴定及系统发育分析3.2.2 病原菌培养特性观察利用组织分离法对所采集带有典型病斑的楠木枝条进行病原菌分离纯化，得到75 株菌株，根据培养基生长特性以及切片镜检结果将其分为 2 组。第一组:菌 A 在 PDA 平板上生长速度较快，25℃条件下 2 天即可长满 90 mm 培养皿。25℃条件下生长速度为 16～19 mm/d。菌落早期呈现白色或灰白色，气生菌丝较少，后期随着色素沉淀变为墨黑色，气生菌丝发达，呈蛛丝状，簇状直立生长。初期菌丝无隔，无色透明，后期菌丝有隔。产孢细胞透明，无隔，圆柱形;分生孢子初期透明无色，单胞，卵形或椭圆形，壁厚表面光滑，成熟后深褐色，双胞，有隔，测量 50 个分生孢子的大小为（12.6～16.2） μm×（22.4～32.2） μm，L/W 比为 1.8～2.0。子实体的产生需要 30 天左右，表生，黑色近碳质，周围有绒状灰黑色菌丝。根据病原菌的菌落特征和形态特征，初步确定该病原物为 Botryosphaeriaceae 真菌。

菌种,形态特征,培养基

图 3.2 菌种 B 的形态特征Fig 3.2 Microscopic characteristics of strain B3.2.3 病原菌孢子诱导分离所得菌株在 PDA 培养基上生长速度均较快，在燕麦培养基以及杨树皮煎汁培养基上生长速度较慢，在 2％杨树枝条水琼脂培养基菌上生长速度最慢。杨树树皮煎汁培养基上，气生菌丝不发达，紧贴培养基，稀疏且长势较弱，孢子诱导效果略好于 PDA 培养基，30 左右部分培养基表面产生子实体，少且分散。燕麦培养基上菌株生长较弱，气生菌丝较少，菌株生长紧贴培养基，几乎没有孢子产生。2％杨树枝条水琼脂培养基上，几乎没有气生菌丝，20 天后大部分培养基均产生子实体，能够进行徒手切片制作。改善光照条件对于诱导菌株产孢有一定作用，将菌落表面划碎或刮伤使菌丝体收到损伤也可以诱导菌株产生分生孢子。

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